universidad central del ecuador facultad de medicina veterinaria y

Escherichia coli es un bacilo recto gram negativo. Mide entre 1 y 1,5µm x 2 y 6µm, pueden aparecer aislados o en pares. (Stanchi, 2007). Es móvil, no forma esporas, y son anaerobias facultativas (Forbes, Sahm, & Weissfeld, 2007). Es oxidasa negativo, fermenta la glucosa, reducen los nitratos, son catalasa positivos.
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

CUANTIFICACIÓN DE Escherichia coli PRODUCTOR DE β - LACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO (BLEE) EN PUNTOS CRÍTICOS DE CONTROL EN CAMALES INDUSTRIALES DE LA PROVINCIA DE PICHINCHA.

Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar el Título de Médico Veterinario Zootecnista

AUTORA ESTEFANÍA ALEJANDRA PÉREZ CELORIO

TUTOR Dr. Christian Vinueza Msc.

Quito, Julio, 2015

II

III

IV

ÍNDICE GENERAL

V CONTENIDO

ÍNDICE DE TABLAS ............................................................................................... 6 ÍNDICE DE GRÁFICOS .......................................................................................... 7 ÍNDICE DE ANEXOS .............................................................................................. 7 RESUMEN .............................................................................................................. 8 DEDICATORIA ...................................................................................................... 10 AGRADECIMIENTO .............................................................................................. 11 INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 12 CAPÍTULO I .......................................................................................................... 13 EL PROBLEMA ..................................................................................................... 13 Planteamiento del Problema .............................................................................. 13 Objetivos ............................................................................................................ 14 Justificación ....................................................................................................... 14 CAPITULO II ......................................................................................................... 17 MARCO TEÓRICO ................................................................................................ 17 Antecedentes de la investigación ....................................................................... 17 Fundamentación Teórica ................................................................................... 18 CAPÍTULO III ........................................................................................................ 33 METODOLOGÍA.................................................................................................... 33 Determinación de los métodos a utilizar ............................................................ 33 Diseño de la investigación ................................................................................. 33 Descripción de la zona de estudio ..................................................................... 33 Población ........................................................................................................... 33 Técnicas e Instrumentos de Recolección de la Información .............................. 36 Técnicas de Laboratorio ..................................................................................... 36 CAPÍTULO IV ........................................................................................................ 40 RESULTADOS ...................................................................................................... 40 Presentación de Resultados .............................................................................. 40 Discusión ........................................................................................................... 49

VI CAPÍTULO V ......................................................................................................... 53 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ........................................................ 53 Conclusiones ..................................................................................................... 53 Recomendaciones ............................................................................................. 54 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 55 LISTADO DE ABREVIATURAS ............................................................................ 66 ANEXOS ............................................................................................................... 68

ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Clasificación científica de Escherichia coli. ................................................. 19 Tabla 2. Patotipos de Escherichia coli. ...................................................................... 20 Tabla 3. Principales β – lactamasas .......................................................................... 26 Tabla 4. Identificación y ubicación de los camales industriales de aves de la provincia de Pichincha. ............................................................................................. 34 Tabla 5. Descripción de los puntos y unidades de muestreo. ................................... 34 Tabla 6. Número total de muestras procesadas durante la investigación. ................ 41 Tabla 7. Características de la línea de faenamiento de cada una de las empresas.. 41 Tabla 8. Promedio de UFC/g (Log10) de E. coli BLEE y Desviación Estándar por muestreo en empresas 1CT y 2CT. .......................................................................... 42 Tabla 9. Promedio de UFC/ml (Log10) de E. coli BLEE y ppm de Cloro de los tanques de Enfriamiento de las empresas 1CT y 2CT. ............................................. 46 Tabla 10. Prueba Shapiro - Wilk empresa 1CT y 2CT. ............................................. 47 Tabla 11. Análisis de varianza empresa 2CT. ........................................................... 47 Tabla 12. Correcciones de Bonferroni empresa 2CT. ............................................... 49

VII ÍNDICE DE GRÁFICOS Gráfico 1. Sitios de colonización de Escherichia coli patógena. ................................ 21 Gráfico 2. Estructura antigénica de las Enterobacterias. ........................................... 23 Gráfico 3. Descripción de la siembra en agar TBX+C. .............................................. 38 Gráfico 4. Aislamiento de Escherichia coli productor de β - lactamasas de espectro extendido en el medio TBX +C. ................................................................................. 40 Gráfico 5. Promedio de UFC/g (Log10) de Escherichia coli BLEE en cada punto muestreado en la empresa 1CT. ............................................................................... 43 Gráfico 6. Promedio de UFC/g (Log10) de Escherichia coli BLEE en cada punto muestreado en la empresa 2CT. ............................................................................... 44 Gráfico 7. Promedio y desviación estándar de UFC/g (Log10) de Escherichia coli BLEE en las empresas 1CT y 2CT............................................................................ 45 Gráfico 8. UFC/ml (Log10) de Escherichia coli BLE y ppm de cloro en los tanques de enfriamiento de la empresa 1CT. ......................................................................... 46

ÍNDICE DE ANEXOS Anexo 1. Esquema de aislamiento de E. coli BLEE. ................................................. 69 Anexo 2. Crioconservación de cepas de Escherichia coli BLEE ............................... 69 Anexo 3. Tabla de registro de información de las parvadas muestreadas. ............... 71 Anexo 4. Tabla de registro de registro de resultados de cuantificación de Escherichia coli BLEE. .............................................................................................. 72 Anexo 5. Preparación del Agar TBX+C y del Caldo TSB. ......................................... 73 Anexo 6. Promedio, Varianza, Desviación estándar y Coeficiente de Variación de E. coli BLEE (Log10/g) por muestreo en la empresa 1CT. ......................................... 74 Anexo 7. Promedio, Varianza, Desviación estándar y Coeficiente de Variación de E. coli BLEE (Log10/g) por muestreo en la empresa 2CT. ........................................ 76 Anexo 8. Promedio y Desviación Estándar de UFC (Log10/g) de E. coli BLEE empresa 1CT............................................................................................................. 79 Anexo 9. Promedio y Desviación Estándar de UFC (Log10/g) de E. coli BLEE empresa 2CT............................................................................................................. 80

VIII UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CUANTIFICACIÓN DE Escherichia coli PRODUCTOR DE β ESPECTRO EXTENDIDO (BLEE)

LACTAMASAS DE

EN PUNTOS CRÍTICOS DE CONTROL EN

CAMALES INDUSTRIALES DE LA PROVINCIA DE PICHINCHA. Autora: Estefanía Alejandra Pérez Celorio Tutor: Dr. Christian Vinueza M. Sc. Fecha: Julio, 2015

RESUMEN Escherichia coli productor de β - lactamasas de Espectro Extendido (BLEE) ha sido aislado en carcasas de pollos destinados al consumo humano, estas cepas transfieren sus genes a bacterias del tracto gastrointestinal por medio de un plásmido de transferencia y estas a su vez pueden actuar como fuente de infección en el organismo. El objetivo del presente estudio fue cuantificar E. coli BLEE en puntos críticos de control en dos camales industriales de pollos en la provincia de Pichincha. Se tomaron tres tipos de muestras: piel de la pechuga de las carcasas, ciegos y agua de los tanques de enfriamiento. Las muestras de piel se tomaron en diferentes etapas del faenamiento (después del desplume, después del eviscerado, antes y después del enfriamiento). Se cuantificó E. coli BLEE realizando diluciones decimales en agar TBX suplementado con Cefotaxima. La empresa 1CT presentó variables niveles de contaminación entre los muestreos, lo que indica una falta de uniformidad entre los procesos de faenamiento. Las variaciones encontradas en la empresa 2CT demostraron diferencias significativas de contaminación en el eviscerado con un incremento de 0,54 UFC/g Log10 y después del enfriamiento con una disminución de 1,1 UFC/g Log10 E. coli BLEE. En conclusión, la evisceración es un punto crítico de control que debe ser mejorado para asegurar la calidad microbiológica del producto debido a que las duchas aplicadas entre la evisceración y antes del enfriamiento no surtieron el efecto esperado en la disminución de la carga bacteriana de las carcasas. En contraste, los niveles de cloro utilizados en el agua de los tanques de enfriamiento sí disminuyen la contaminación de las canales. Palabras clave: E. coli BLEE, Cuantificación, Punto crítico de control, Pichincha

IX CENTRAL UNIVERSITY OF ECUADOR FACULTY OF VETERINARY MEDICINE SCHOOL OF VETERINARY MEDICINE

QUANTIFICATION OF EXTENDED SPECTRUM β- LACTAMASE PRODUCING Escherichia

coli

IN

CRITICAL

CONTROL

POINTS

IN

INDUSTRIAL

SLAUGHTERHOUSES AT PICHINCHA PROVINCE. Author: Estefanía Alejandra Pérez Celorio Tutor: Dr. Christian Vinueza M. Sc. Date: Julio, 2015

ABSTRACT Extended- Spectrum β-Lactamase producing Escherichia coli (ESBL) has been isolated from chicken carcasses destined for human consumption, these strains transfer their genes to bacteria in the gastrointestinal tract by means of a transfer plasmid and these can act as a source of infection in the body. The objective of this study was to quantify ESBL E. coli at critical control points in two industrial poultry slaughterhouses at Pichincha Province. Three types of samples were taken: breast skin carcasses, ceca and water cooling tanks. Skin samples were taken at different stages of slaughtering (after defeathering, after evisceration, before and after cooling). ESBL E. coli was quantified performing decimal dilutions in TBX agar supplemented with Cefotaxime. The company 1CT presented varying levels of contamination between samples, indicating a lack of uniformity among slaughter processes. The variations found in company 2CT show significantly differences of contamination in the evisceration with an increase of 0.54 CFU / Log10 and after cooling with a decrease of 1.1 CFU / g Log10. In conclusion, evisceration is a critical control point should be improved to ensure the microbiological quality of the product because the showers applied between the evisceration and before chilling have not the effect expected in reducing the bacterial load of the carcass. In contrast, levels of chlorine used in the water of cooling tank itself decrease the contamination of carcasses. Keywords: E. coli ESBL, Quantification, Critical Control Point, Pichincha

X

DEDICATORIA

A mis ángeles, que aunque no se encuentren físicamente conmigo su amor vive en mi corazón.

XI AGRADECIMIENTO

Agradezco a mi Padre Celestial, sin él nada de esto hubiese sido posible. A mis padres y hermanos por su amor y su ejemplo, gracias a ellos he podido llegar a este punto de mi vida. A mi novio, por su apoyo incondicional y la fortaleza que me brinda día a día. Al Doctor Christian Vinueza, por la confianza que depositó en mí, por su paciencia y por toda la ayuda en la realización de esta investigación. A los doctores Marco Cisneros, María Belén Cevallos, María Inés Baquero, Carlos Gómez por cada experiencia compartida. A las empresas, por su amable cooperación en este estudio. A todas las personas que ayudaron a materializar este sueño: Cristina, Jonathan, Verónica, Marco, Jorge, Cristian, por su invaluable ayuda. A

todos

muchísimas

gracias.

INTRODUCCIÓN

Escherichia coli es un microorganismo que normalmente se encuentra en el intestino de humanos y animales jugando un rol importante en la digestión y absorción de nutrientes y vitaminas (Hayhurst, 2004). Cientos de cepas son inofensivas pero otras como Escherichia coli O157:H7, cepa productora de la toxina shiga, causan graves intoxicaciones en humanos incluyendo los principales brotes de enfermedades causadas por alimentos contaminados (Ahmed & Shimamoto, 2014). Escherichia coli está asociado a infecciones intestinales y extraintestinales como: meningitis, diarrea, infecciones en el tracto urinario, peritonitis, septicemia y neumonía (Hammerum & Heuer, 2009). Con frecuencia los antibióticos empleados en animales y humanos para el tratamiento de estas enfermedades son los mismos, aumentando así el riesgo de aparición y propagación de bacterias resistentes (WHO, 2014). Estudios recientes han sugerido la transmisión de cepas de E. coli y sus genes de resistencia a los seres humanos por el consumo de la carne de pollo (de Been et al., 2014). La presente investigación se realizó en el laboratorio de Bacteriología y Micología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, aplicando técnicas microbiológicas que permitieron la cuantificación de E. coli BLEE en cuatro puntos críticos de control, en muestras de agua procedentes de los tanques de enfriamiento y en el contenido cecal de pollos faenados en dos camales industriales de la provincia de Pichincha.

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CAPÍTULO I

EL PROBLEMA

Planteamiento del Problema Escherichia coli es una bacteria que forma parte de la microflora intestinal normal del intestino de seres humanos y otros animales de sangre caliente. La mayoría de cepas no son patógenas, sin embargo hay otras causantes de enfermedades como: síndrome urémico hemolítico, meningitis en recién nacidos, peritonitis entre otras, además es uno de los principales agentes asociados a enfermedades de transmisión alimentaria (WHO, 2014). La carne de pollo es un reservorio importante de E. coli ya que durante el faenamiento el contenido fecal del intestino puede contaminar las carcasas (Gladys & Olayinka, 2014; Miranda et al., 2008). Un problema aun mayor es que estas cepas pueden llevar en su información genética la codificación de enzimas que le permiten resistir el mecanismo de acción de los antibióticos como es el caso de las β - lactamasas (Depoorter et al., 2012; Seiffert et al., 2013). Se ha demostrado que la contaminación de carne de pollo con E. coli productor de β- lactamasas de espectro extendido (BLEE) contribuye al aumento de la incidencia de infecciones con estas bacterias en los seres humanos (Cohen Stuart et al., 2012). Si la infección con E. coli BLEE se desarrolla en el ser humano, es posible que no respondan a los tratamientos estándar, dando lugar a una enfermedad prolongada y un mayor riesgo de muerte (da Silva & Mendonça, 2012).

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FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ¿Se podrá cuantificar Escherichia coli productor de β - lactamasas de espectro extendido (BLEE)

en puntos críticos de control en camales industriales de la

provincia de Pichincha?

Objetivos Objetivo General: Cuantificar Escherichia coli productor de β - lactamasas de espectro extendido (BLEE) en puntos críticos de control en camales industriales de la Provincia de Pichincha. Objetivos Específicos: 1. Cuantificar Escherichia coli

productor de β - lactamasas de espectro

extendido (BLEE) por medio de técnicas de aislamiento cuantitativo. 2. Correlacionar la presencia de Escherichia coli BLEE

entre los puntos

críticos de control de los camales muestreados.

Justificación Escherichia coli es una bacteria con forma de bacilo, Gram negativo que está asociado

a

diversas

enfermedades

gastrointestinales,

e

infecciones

extraintestinales como afecciones urinarias, meningitis y sepsis (Murray, Rosenthal, & Pfaller, 2009). Esta bacteria actúa como comensal o patógeno en seres humanos y animales, se encuentra en el medio ambiente y su presencia en alimentos y agua es un indicador de contaminación fecal (Zhao et al., 2012).

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Los antibióticos β- lactámicos son una de las opciones para el tratamiento de infecciones causadas por estas bacterias. Esto promueve la generación de mecanismos de resistencia en estos microorganismos, como la producción de β lactamasas de espectro extendido (BLEE) que actúan hidrolizando el anillo βlactámico de dichos antibióticos (Ma et al., 2012). E. coli es uno de los microorganismos que son comúnmente resistentes a antibióticos (Abreu et al., 2014). La Organización Mundial de la Salud señala que en la Unión Europea cerca de 25000 muertes anuales se dan por infecciones provocadas por bacterias resistentes a antibióticos (WHO, 2011a). La infección por E. coli BLEE se puede dar por consumo o manipulación de alimentos contaminados, principalmente carne de pollo (Smet et al., 2011). Estas cepas son capaces de transferir sus genes a las bacterias de la microflora intestinal a través de un plásmido de transferencia y estas a su vez pueden actuar como fuente de infección en otras partes del organismo (Abreu et al., 2014). La infección en humanos con organismos productores de betalactamasas a través de la cadena alimenticia, ha sido ampliamente discutida; se han realizado estudios en los que se demuestran la presencia de estos microorganismos en aves de corral y en carne de pollo (Leistner et al., 2013; Abreu et al., 2014). Se ha observado un aumento en la prevalencia de Escherichia coli BLEE en el tracto gastrointestinal de pollos broiler, con rangos que van de 3% en el año 2003 a 15% en el 2008 (Abreu et al., 2013). Durante el procesamiento de aves en los camales, las carcasas pueden contaminarse por la manipulación y por los procesos propios del faenamiento. Escherichia coli, Campylobacter y Salmonella revisten gran importancia en la salud pública al ser descritos como los principales agentes etiológicos de las enfermedades transmitidas por los alimentos en todo el mundo (Gladys & Olayinka, 2014). De acuerdo con esto se han identificado los puntos críticos de 15

riesgo para la contaminación de las carcasas de pollos, estos son: el desangrado, desplumado, evisceración, pre-enfriamiento, enfriamiento y envasado (Molero, 2012; Tsola, Drosinos, & Zoiopoulos, 2008). Siendo los puntos críticos de una planta de faenamiento, la fase del proceso en donde se puede aplicar un control que es esencial para prevenir o eliminar un peligro relacionado con la inocuidad de los alimentos o para reducirlo a un nivel aceptable (Ulrich, 2012). En Ecuador, en 2011 un estudio de caracterización molecular de Escherichia coli uropatogénica resistente a antibióticos, reveló

un 22,4% de resistencia a β-

lactámicos de amplio espectro (Chiluisa, Vásquez, Zahner, & Silva, 2014). En el país no se han realizado investigaciones sobre Escherichia coli BLEE en alimentos de origen animal (carne de pollo destinada al consumo humano), y tomando en cuenta que el promedio del consumo per cápita de carne de pollo en Ecuador es de 35 kg por habitante (CONAVE, 2013), es de suma importancia aportar con datos que nos permitan tener una visión más clara acerca de epidemiología de esta bacteria en el país. Al término de esta investigación se obtuvieron datos cuantitativos de Escherichia coli BLEE de muestras procedentes de 4 puntos críticos de control (Después del desplume, después del eviscerado, antes y después del Enfriamiento), muestras de ciegos y de agua de los tanques de enfriamiento en dos camales industriales de la provincia de Pichincha. Los puntos críticos seleccionados se identificaron tomando en cuenta las características del proceso de faenamiento y fueron considerados como los de mayor riesgo para la contaminación de las carcasas.

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CAPITULO II

MARCO TEÓRICO

Antecedentes de la investigación En el año 2012, en Japón, se analizaron 41 hisopados cloacales en pollos broiler pertenecientes a cuatro granjas comerciales, en el 100% de las muestras se aisló Escherichia coli productor de β- lactamasas (Kameyama et al., 2013). En Estados Unidos, Pensilvania, un estudio de 104 muestras de carne de pollo cruda de tres cadenas comerciales, se obtuvo un total de 9 muestras en las que se identificó Escherichia coli BLEE (Park et al., 2012). En Brasil en 2014, se aisló Escherichia coli resistente a múltiples antibióticos en carne de pollo expendida en supermercados, estas cepas fueron portadoras de variantes genéticas blaCTXM -2 o blaCTXM – 8 (Casella et al., 2015). En Ecuador, en 2012, se aisló Escherichia coli de muestras de pechuga de pollo procedentes de diferentes mercados comerciales de la Provincia de Loja, de las 77 muestras tomadas, el 47%

(36/77) estuvieron contaminadas con E. coli

(Fernández, 2012). En el año 2014, se realizó un estudio en donde se aisló E. coli BLEE en ciegos de pollos faenados en camales industriales de la provincia de Pichincha. Los resultados indican que de 145 muestras analizadas el 86,89% (126/145) fueron positivas a E. coli BLEE (Vásconez Paucar, 2014). Por lo expuesto anteriormente en nuestro país no se han realizado estudios de cuantificación de Escherichia coli BLEE en carne de pollo.

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Fundamentación Teórica

Historia de Escherichia coli y la resistencia a antibióticos Escherichia coli fue descubierta en 1885 por el pediatra alemán Theodore Escherich durante los estudios que realizó en la flora fecal de neonatos e infantes, denominándola inicialmente como Bacterium coli commune debido a su presencia en pacientes sanos y enfermos (Donnenberg, 2002). En 1928, Alexander Fleming descubre la primera penicilina (García Hernández et al., 2011) al observar que el hongo

identificado como Penicillium notatum

provocaba la lisis de colonias de Staphylococcus (Fleming, 2001). Tan pronto como se descubrieron los antibióticos, apareció la resistencia de las bacterias a los mismos, es así que Abraham y Chain en 1940 descubren la enzima Penicilinasa, describiéndola como una sustancia en B. coli (ahora Escherichia coli) que inactivaba la acción de la penicilina (Abraham & Chain, 2001; Turner, 2005). Dentro de los mecanismos de resistencia bacteriana destaca el de las βlactamasas de espectro extendido (BLEE), cuya aparición en los años ochenta se atribuyó al uso masivo de cefalosporinas de amplio espectro y aztreonam (García Hernández et al., 2011).

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Clasificación taxonómica de Escherichia coli Escherichia coli pertenece a la orden Eubacteriales, familia Enterobacteriaceae, tribu Escherichiae, género Escherichia, especie coli (Koneman et al., 2006). Tabla 1. Clasificación científica de Escherichia coli. Dominio

Bacteria

Reino

Bacteria

Filo

Proteobacteria

Clase

Gamma Proteobacteria

Orden

Eubacteriales

Familia

Enterobacteriaceae

Tribu

Escherichieae

Género

Escherichia

Especie

coli Tomado de: Koneman et al., 2006 Modificado por: La autora

Dentro del Género Escherichia se hallan otras especies como: E. adecarboxylata, E. blattae, E. fergusonii, E. hermanii y E. vulneris, de las cuales solo E. coli reviste importancia (Brune, 2013). Existen cepas comensales y cepas patógenas de Escherichia coli, el primer grupo tiene su nicho en la mucosa intestinal de los mamíferos, siendo el anaerobio facultativo más numeroso de la microflora intestinal humana.

Estas cepas no

desarrollan

en

sintomatología

en

el

hospedador,

excepto

casos

de

inmunosupresión o daño de las barreras gastrointestinales como en la peritonitis (Kaper, Nataro, & Mobley, 2004). Las cepas virulentas de Escherichia coli, poseen factores que les permiten colonizar mucosas y posteriormente producir la enfermedad, se diferencian clínicamente de otras por su epidemiología, sintomatología,

las respectivas

19

enfermedades que causan y las interacciones con las células del hospedador (Croxen & Finlay, 2010; Quinn et al., 2011). Además E. coli patógena se agrupa en dos categorías: patógenos Extra intestinales que son los responsables de las infecciones del tracto urinario y de meningitis (E. coli uropatógena, E. coli asociada a meningitis), y

patógenos

entéricos (Bélanger et al., 2011; da Silva & Mendonça, 2012). Dentro del último grupo se distinguen

6 patotipos de E. coli con diferentes

mecanismos de patogenicidad que actúan como agentes etiológicos de infecciones intestinales (Rodríguez-Angeles, 2002). Tabla 2. Patotipos de Escherichia coli. PATOTIPO

NOMBRE

ETEC

E. coli Enterotoxigénica

EAEC

E. coli Enteroagregativa

DAEC

E. coli de Adherencia difusa

EHEC

E. coli Enterohemorrágica

EPEC

E. coli Enteropatogénica

EIEC

E. coli Enteroinvasiva Tomado de: Murray et al., 2009 Modificado por: La autora

20

Gráfico 1. Sitios de colonización de Escherichia coli patógena.

Escherichia coli puede colonizar varios sitios del cuerpo humano como: el riñón, la vejiga, intestino, cerebro.

Tomado de: Croxen & Finlay, 2010

La serotipificación de E. coli se realiza en base a los antígenos somáticos (O), flagelares (H) y capsulares (K). La combinación de los antígenos O y H definen los serotipos, actualmente se conocen alrededor de 170 serogrupos con diferentes antígenos O (Koneman et al., 2006; Murray et al., 2009).

Características fisiológicas y estructurales de Escherichia coli Escherichia coli es un bacilo recto gram negativo. Mide entre 1 y 1,5µm x 2 y 6µm, pueden aparecer aislados o en pares. (Stanchi, 2007). Es móvil,

no forma

esporas, y son anaerobias facultativas (Forbes, Sahm, & Weissfeld, 2007). Es oxidasa negativo, fermenta la glucosa, reducen los nitratos, son catalasa positivos y no produce ácido sulfhídrico (Murray et al., 2009).

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El rango de temperatura en la que crece E. coli oscila entre los 7 y 50°C, con una temperatura óptima de 37°C, resisten un pH de 4,4 y pueden proliferar en alimentos con una actividad mínima de agua (Aw)de 0,95 (WHO, 2011b). Esta bacteria se recupera con facilidad a partir de muestras clínicas sembradas en medios comunes o selectivos como agar MacConkey, Chromocult, agar Eosina azul de metileno, incubadas a 37° C bajo condiciones aeróbicas (Quinn et al., 2011).

Escherichia coli está constituida por la cápsula, pared bacteriana, membrana externa, pili o fimbrias, los flagelos perítricos (Stanchi, 2007).

La cápsula tiene actividad antigénica, está formada por polisacáridos (Stanchi, 2007), al parecer brinda la capacidad de evitar la fagocitosis e impide la acción bactericida del suero humano (Abreu Rodríguez, 2012).

La pared celular protege a la bacteria del daño mecánico y de la lisis osmótica, formada por una membrana interna o citoplasmática y el peptidoglicano (mureína), (Quinn et al., 2011), consta del espacio periplásmico donde se encuentran las enzimas degradativas como la fosfatasa alcalina, proteasas, β- lactamasas, nucleosidasas y aminoglucósido fosforilasa (Koneman et al., 2006).

La membrana externa es una bicapa lipídica asimétrica, constituida por la membrana interna (formada por fosfolípidos) y la capa externa que consta de moléculas de lipopolisacáridos (LPS) termoestables. Los LPS tienen tres dominios: el polisacárido O somático más externo, la región bisagra (antígeno común enterobacteriano), y el lípido A responsable de la actividad de la toxina (Murray et al., 2009).

Las fimbrias o pili comprenden dos clases generales: las fimbrias comunes codificadas por el cromosoma, y los pili sexuales que son codificados por 22

plásmidos conjugativos (Quinn et al., 2011), intervienen en la adhesión a las células del hospedador, la autoagregación y el intercambio genético mediante conjugación (Abreu Rodríguez, 2012).

E. coli posee entre 5 a 10 flagelos distribuidos alrededor de la superficie, permiten la rotación y el movimiento de la bacteria en ambientes (Moredo, 2012).

Los plásmidos constituyen elementos extracromosómicos formados por moléculas circulares de ADN bicatenario que se replican de forma autónoma, sirven como elementos de intercambio genético y propagación de genes de resistencia (Akingbade et al., 2014). Gráfico 2. Estructura antigénica de las Enterobacterias.

Tomado de: Murray et al., 2009

23

Resistencia a Antibióticos Los antibióticos son sustancias que inhiben la replicación de los microorganismos, por lo que se emplean para el tratamiento de enfermedades infecciosas (OMS, 2013). La resistencia a los antibióticos que se produce en las bacterias implican un serio problema de salud pública (Mahmood, Roy, Siddiqui, & Shamim, 2015), la OMS define como resistencia a los antibióticos a la resistencia de un microorganismo a un medicamento antimicrobiano al que originalmente era vulnerable (OMS, 2013). Los

antibióticos

β-lactámicos

constituyen

la

familia

más

numerosa

de

antimicrobianos, están constituidos por un anillo β-lactámico formado por la condensación de alanina y β-dimetilcisteína (Abreu Rodríguez, 2012). La acción bactericida de los β-lactámicos se da en la última fase de la síntesis del peptidoglicano de la pared celular, ya que interfieren de forma competitiva sobre las proteínas fijadoras de penicilina (PBP) que son las responsables de producir una serie de enlaces cruzados entre las cadenas de los péptidos. Estos enlaces precisamente confieren mayor rigidez a la pared bacteriana (García, Botteldoorn, & Dierick, 2013). La inhibición generada por los antibióticos β-lactámicos provoca la acumulación de los precursores de peptidoglicano, lo que produce la activación de la enzima bacteriana autolisina que destruyen el remanente de peptidoglicano. La ausencia de la pared celular en las bacterias hace que estas estallen o sean fagocitadas con mayor facilidad (Marín & Gudiol, 2003; Suárez & Gudiol, 2009). En microorganismos Gram negativos como Escherichia coli la resistencia a antibióticos está mediada principalmente por genes móviles en plásmidos que se transmiten fácilmente a las poblaciones bacterianas (Kumarasamy et al., 2010). La producción de enzimas β - lactamasas es el mecanismo de resistencia a los antibacterianos más común en los miembros de la familia Enterobacteriaceae,

24

provocan la hidrólisis del anillo β- lactámico de los antibióticos anulando su acción (Cortés et al., 2010). Existen dos grupos de β - lactamasas: las β - lactamasas del tipo AmpC, y las del tipo BLEE. Las primeras son Serin β - lactamasas o también llamadas cefalosporinasas. Son codificadas por cromosomas, hidrolizan a las aminopenicilinas, cefalosporinas de primera generación, cefamicinas (cefoxitina, cefotetán) y aminopenicilinas combinadas con inhibidores de β - lactamasas (Martínez Rojas, 2009; Tafur, Torres, & Villegas, 2008). Las enzimas tipo BLEE (β - lactamasas de espectro Extendido) degradan las oxiimino-cefalosporinas (cefotaxima, ceftazidima),

confieren resistencia a las

bacterias contra las penicilinas, cefalosporinas de primera, segunda,

tercera

generación y aztreonam, a diferencia de las enzimas de tipo AmpC, estas son sensibles a los inhibidores de β – lactamasas como el ácido clavulánico, sulbactam, tazobactam (El Salabi, Walsh, & Chouchani, 2012; Kar et al., 2015; Mosquito, Ruiz, & Ochoa, 2011).

25

Tabla 3. Principales β – lactamasas Familia

Grupo/ subgrupo

No. de

funcional

enzimas

Enzimas representativas

CMY

1, 1e

50

CMY -1 a CMY- 50

TEM

2b, 2be, 2br, 2ber

172

2b

12

TEM -1, TEM – 2, TEM – 13

2be

79

TEM -3. TEM- 10, TEM-26

2br

36

TEM-30 (IRT-2), TEM -31 (IRT-3),TEM – 163

2ber

9

TEM -50 (CMT- 1), TEM -158 (CMT -9)

2b, 2be, 2br

127

2b

30

SHV -1, SHV – 11, SHV -89

2be

37

SHV – 2, SHV – 3, SHV – 115

2br

5

SHV – 10, SHV – 72

CTX-M

2be

90

CTX –M -1, CTX-M-44, a CTX –M- 92

PER

2be

5

PER -1 a PER – 5

VEB

2be

7

VEB -1 a VEB- 7

GES

2f

15

GES – 2 a GES -7, GES -15

KPC

2f

9

KPC- 2 a KPC-10

SME

2f

3

SME -1, SME- 2, SEM -3

OXA

2b, 2de, 2dr

SHV

158

2d

5

OXA -1, OXA -2, OXA -10

2de

9

OXA -11, OXA – 14, OXA -15

2df

48

OXA -23, OXA – 51, OXA -58

IMP



26

IMP -1, IMP -26

VIM

3a

23

VIM – 1, VIM – 23

IND



8

IND -1, IND -2, IND -2a, IND -3, a IND -7

Tomado de: Bush & Jacoby, 2010 Modificado por: La Autora

Estudios realizados demuestran que los genes más prevalentes son blaCTX-M-2, blaCTX-M-8, blaCMY-2, blaCTX-M-1 en la carne de pollo (Chong, Ito, & Kamimura, 2011; Egervärn et al., 2014).

26

Distribución Geográfica y Reservorios de Escherichia coli BLEE Escherichia coli tiene una distribución mundial, y debido a su presencia en el tracto gastrointestinal de animales y humanos, contaminan la vegetación, el suelo y el agua (FAO, 2011). E. coli productor de enzimas BLEE/AmpC ha sido detectado en animales como cerdos, caballos, ganado bovino, perros, gatos y particularmente en aves de corral (Cortés et al., 2010). El tracto gastrointestinal de pollos broiler sanos es considerado un importante reservorio de E. coli BLEE (Bergenholtz, Jørgensen, Hansen, Jensen, & Hasman, 2009). Varios estudios demuestran la presencia de E. coli BLEE en la carne de pollo, es así que en países como Holanda, Alemania y España la prevalencia de E. coli BLEE en carne de pollo varía del 44 a 93% (Egea et al., 2012; Kola et al., 2012; Overdevest et al., 2011) . En Suiza se aisló E. coli BLEE en carne de pollo importada, obteniendo una prevalencia del 95%, 61% y 15%

en carne procedente de Brasil, Europa y

Dinamarca respectivamente (Egervärn et al., 2014), mientras que en Bélgica la prevalencia de E. coli BLEE en carne de pollo es del 42% (García et al., 2013). En Colombia se asiló E. coli resistente a múltiples antibióticos en un 83% en la carne de pollo analizada (Donado et al., 2015), y en Brasil se aislaron 121 cepas de E. coli BLEE en carne de pollo, siendo CTX-M la principal enzima hallada (Koga et al., 2015).

27

Transmisión Las enfermedades transmitidas por los alimentos son una importante causa de morbilidad y mortalidad en el mundo entero (Stein et al., 2007), así de acuerdo al CDC Escherichia coli O157:H7 ha sido responsable de 265000 infecciones cada año en Estado Unidos (CDC, 2015). Escherichia coli se transmite a los humanos por el consumo de alimentos contaminados (carnes poco cocidas, vegetales), agua contaminada con restos fecales, de persona a persona o a través de animales de granja (Berger et al., 2010; Mead, 2004). La carne de pollo es considerada como una fuente de transmisión de E. coli y genes de resistencia, se ha documentado la presencia de mismo tipo genético de E. coli BLEE en pollos y en seres humanos, representando un riesgo para la producción avícola y la salud humana (Leverstein-van Hall et al., 2011; Olsen, Bisgaard, Löhren, Robineau, & Christensen, 2014; Overdevest et al., 2011; Voets et al., 2013). Otra importante vía de transmisión es la contaminación cruzada,

se ha

demostrado que el corte y trituración de vegetales aumenta el riesgo de contaminación cruzada con Escherichia coli O157: H7 (Zilelidou, Tsourou, Poimenidou, Loukou, & Skandamis, 2014) . Escherichia coli BLEE ha sido aislado también en las tablas empleadas para cortar los alimentos y en las manos de cocineros, lo que indica una potencial fuente de transmisión de estos microorganismos durante la preparación de alimentos (Tschudin-Sutter et al., 2014).

28

Contaminación de carcasas durante el faenamiento La carne de pollo puede estar contaminada con microorganismos como E. coli, Campylobacter, Salmonella, Listeria, que son considerados como los principales agentes patógenos transmitidos por los alimentos en la industria avícola (Bhaisare, Thyagarajan, Churchil, & Punniamurthy, 2014; Grashorn, 2010). Las carcasas son particularmente susceptibles a la contaminación microbiana debido a su pH

(cercano a la neutralidad), a su riqueza en compuestos

nitrogenados (aminoácidos) y a la gran humedad. Estos factores favorecen el desarrollo de microorganismos en el músculo y piel de la carne de pollo (Maciel, Carvalho, Wiest, Majolo, & Fröder, 2012). Los microorganismos encontrados en las plantas de faenamiento industriales provienen de dos fuentes principales: el ambiente del camal y el tracto digestivo de las aves (Tsola et al., 2008). La carga bacteriana del ambiente ha sido aislada en muestras de aire, suelo, agua, las superficies del equipo y en los operadores de las plantas (Doyle & Buchanan, 2013). Mientras que el proceso de faenamiento se divide en dos zonas principales: la zona sucia que abarca los procesos de aturdimiento, sangrado, escaldado y eviscerado, y la zona limpia que implica los procesos que se realizan a bajas temperaturas y bajo estricto control de higiene como el enfriamiento y el envasado del producto (Tsola et al., 2008). A su llegada, las aves son ubicadas en el área de recepción considerada como la zona con mayor concentración de contaminación microbiológica (Johnson, 2010). Las aves vivas presentan una alta carga bacteriana en sus intestinos, patas y piel. Durante el proceso de faenamiento los equipos, las manos de los operadores y las carcasas están predispuestos a la contaminación cruzada (Bartkowiak-higgo, 2005).

29

Aturdimiento y Desangrado En Ecuador se emplea el aturdimiento eléctrico empleando una corriente de 80 a 120 volts y de 20 a 45 mAmp (Ulrich, 2012). Esto genera un ataque de tipo epiléptico al ave provocando su insensibilización, y un aumento en la presión sanguínea que va acompañado de un incremento transitorio en la velocidad de los latidos cardíacos. El desangrado se realiza a través del corte de la vena yugular y la arteria carótida (López & Casp, 2004). Debido a que el aturdimiento se realiza empleando al agua como conductor de la electricidad se transfieren bacterias patógenas a las carcasas y equipos (Barco, Belluco, Roccato, & Ricci, 2014).

Escaldado y Desplume El escaldado prepara las carcasas para el desplume. Las aves son sumergidas en agua caliente y por acción de esta se rompen las proteínas que sostienen las plumas y abren sus folículos (Davies, Board, & Board, 1998). En el país se emplea un escaldado alto con temperaturas que fluctúan entre 58 y 60°C. Para el desplume, las carcasas pasan a través de dedos de goma que eliminan mecánicamente las plumas y la capa superior de la piel. En estos procesos la contaminación cruzada se da principalmente por la materia orgánica extraída en las plumas (Gladys & Olayinka, 2014; Keener & Bashor, 2004).

Evisceración En este punto se da la remoción de los órganos internos (intestinos, molleja, hígado). Durante la evisceración las carcasas generalmente son lavadas con el propósito de disminuir la carga bacteriana y la sangre (Grashorn, 2010), sin embargo en este punto se puede presentar contaminación cruzada por la ruptura del tracto gastrointestinal sobre las carcasas (Gladys & Olayinka, 2014). 30

Enfriamiento El enfriamiento se realiza por inmersión de las carcasas en agua, las canales pasan a través de dos o tres tanques con agua fría generalmente con cloro (Bartkowiak-higgo, 2005). En este punto la temperatura de las carcasas disminuye drásticamente e inhibe el crecimiento bacteriano (Barco et al., 2014).

Análisis de Peligros y Puntos Críticos de control El Análisis de Peligro y Puntos Críticos de Control (HACCP) se encarga de la identificación, evaluación y control de peligros sean estos biológicos, físicos o químicos en todas las etapas del faenamiento (Tsola et al., 2008). Durante el procesamiento cada punto donde se rompe la piel del ave, donde el equipo tiene contacto directo con carcasas y donde las canales tienen contacto con el agua es crítico (Mead, 2004). La contaminación cruzada puede darse especialmente durante el escaldado, la evisceración y el enfriamiento (Grashorn, 2010). La USDA ha reconocido la utilidad de carga de E. coli como medida para monitorear las condiciones sanitarias durante el faenamiento de aves. De esta manera se especifica dos criterios de evaluación de control de procesos: los establecimientos deben mantener menos de 100 UFC/ml de E. coli en el 80% de las canales lavadas y nunca deben exceder 1000 UFC/ml (Altekruse et al., 2009).

Prevención Debido al reconocimiento de la carne de pollo como una fuente de contaminación de E. coli BLEE para los humanos es esencial tomar medidas preventivas. Para evitar la transmisión de E. coli BLEE o cualquier otro microorganismo se requiere aplicar buenas prácticas de higiene durante el procesamiento de las aves y aplicar un tratamiento bactericida a las carcasas (WHO, 2011b).

31

En cuanto a la preparación de alimentos, tomar en cuenta que E. coli es termosensible, por esto se recomienda la cocción completa de los alimentos (el centro de alcanzar los 70°C) (OMS, 2007) y respetar la temperatura de almacenamiento para evitar la proliferación de bacterias en la carne (García et al., 2013). También es importante utilizar utensilios diferentes (cuchillos, tablas de picar, recipientes) cuando se manipule carnes, pollo o pescado (FAO, 2011). Otra regla fundamental es lavar frutas y verduras utilizando agua microbiológicamente segura (OMS, 2007).

32

CAPÍTULO III

METODOLOGÍA

Determinación de los métodos a utilizar Tipo de Investigación En el presente estudio se realizó una investigación descriptiva, simple aleatoria. Diseño de la investigación En esta investigación se empleó un diseño observacional, transversal descriptivo, ya que las mediciones de la variable a investigar se realizaron en un periodo de tiempo determinado y no fueron manipuladas deliberadamente (Jaramillo & Marínez, 2010). Descripción de la zona de estudio El trabajo de campo se realizó en dos camales industriales en la Provincia de Pichincha, cantón Quito, parroquias: San Antonio de Pichincha y Pintag. El trabajo de laboratorio se efectuó en el Laboratorio de Bacteriología y Micología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador. Población La población objeto de estudio de esta investigación correspondió a parvadas de aves de un mismo galpón y una misma granja faenadas en dos camales industriales de la provincia de Pichincha, durante un periodo de 6 meses. Los nombres de las empresas que colaboraron con este proyecto se mantuvieron en anonimato debido a un convenio de confidencialidad establecido, razón por la cual se emplearon códigos alfanuméricos para identificar las muestras tomadas. 33

Tabla 4. Identificación y ubicación de los camales industriales de aves de la provincia de Pichincha. Código Empresa

Ubicación

1CT

Pintag

2CT

San Antonio de Pichincha Fuente: Investigación directa Elaborado por: La Autora

Muestra Se empleó un muestreo no probabilístico aleatorio de 10 parvadas faenadas en dos camales industrializados de la Provincia de Pichincha, en cada muestreo se tomó pools de 5 muestras de cada punto crítico de control, así como también muestras de ciegos y agua procedentes de los tanques de enfriamiento tal como se describe en la tabla siguiente.

Tabla 5. Descripción de los puntos y unidades de muestreo. CÓDIGO

PUNTO DE MUESTREO

MUESTRA

P

Después del desplume

5 muestras de piel de pechuga

E

Eviscerado

5 muestras de piel de pechuga

A

Antes del

5 muestras de piel de pechuga

Pre- Enfriamiento D

Después del Enfriamiento

W

Agua

5 muestras de piel de pechuga Dos muestras de agua al inicio y al final del

muestreo

procedentes

de

los

tanques de enfriamiento. C

Ciegos

1 muestra (pool de 25 ciegos de pollos) Fuente: Investigación directa Elaborado por: La Autora

34

Toma de Muestras: 

Se identificó 25 carcasas con una ficha atada al ala para la muestra D (después del Enfriamiento).



Se tomó 5 carcasas al azar para las muestras correspondientes a los puntos críticos de control restantes (P, E y A).



Se tomó 25 ciegos en el punto de eviscerado para la muestra C.



Se tomó entre 20 y 30 ml de agua procedente de los tanques de los tanques de enfriamiento al inicio y al final del proceso de faenamiento para la muestra W.

Toma de muestra de piel: 

Se tomó las carcasas con una funda plástica estéril empleada a manera de guante.



Se colocó las carcasas en una superficie limpia, se cortó por el borde la funda plástica con tijeras estériles y se extendió con el fin de obtener un área relativamente estéril alrededor de la carcasa.



Se desinfectó la pinza diente de ratón, el bisturí y las tijeras con alcohol al 70%, luego se flamearon con el propósito de consumir el alcohol residual.



Se tomó con las pinzas y el bisturí aproximadamente 25 gramos de piel de la pechuga del lado izquierdo, realizando un corte desde el cuello hasta la quilla, se continuó el corte en dirección craneal a nivel de las costillas para terminar en el punto inicial procurando tomar la piel cercana al ala y al cuello.



Se colocó las muestras en fundas para Stomacher debidamente identificadas y se almacenaron en un cooler desinfectado.



Se transportó las muestras en refrigeración hasta la llegada al laboratorio.

35

Procedimiento de la Investigación: Se realizó en dos etapas: a. Recolección de la Información: 

Las personas responsables de las plantas de faenamiento proporcionaron la información de las granjas que iban a ser procesadas.



Se tomaron las muestras siguiendo el orden indicado en la tabla 5.

b. Procesamiento de la Información y muestras en el Laboratorio: 

Se cuantificó E. coli BLEE en agar TBX+C, siguiendo el protocolo descrito en el anexo 1.



Se conservó dos cepas de E.coli BLEE a -80°C, de cada punto muestreado (Ver anexo 2).

Técnicas e Instrumentos de Recolección de la Información 

Registro de muestreos: la recolección de información de la muestra se obtuvo a través de un cuestionario (Ver Anexo 3).



Registro de Laboratorio: los datos obtenidos fueron detallados en el registro del Laboratorio de Bacteriología para Cuantificación de E. coli BLEE.

Técnicas de Laboratorio Técnica de procesamiento de la muestra La investigación se realizó en base al Protocolo descrito por el departamento de Veterinaria, de Salud Pública y Seguridad Alimentaria de la Universidad de Gante, a la norma NF ISO 16649-2:2001 y a la norma ISO 6579:2002 (Norma ISO para el Aislamiento de Salmonella sp. que se realizó paralelamente a esta investigación) (ISO, 2002; NRL, 2013) 36

La muestra fue procesada de la siguiente manera: Técnica de dilución: 

Se procesaron las muestras siguiendo el esquema que se presenta en el anexo 1, en el siguiente orden: P, E, A, D, W, C.



Se tomó cada muestra y se realizó la primera dilución con peptona bacteriológica obteniendo la dilución 10-1,



Se homogenizó la dilución en el Stomacher durante un minuto.



Se tomó un mililitro de la dilución 10-1 y se colocó en un tubo de ensayo con 9 mililitros de Peptona Bacteriológica obteniendo la dilución 10-2.



Se tomó un mililitro de la dilución 10-2 y se colocó en un tubo de ensayo con 9 mililitros de Peptona Bacteriológica obteniendo la dilución 10-3.



Se realizó seis diluciones para la muestra de ciegos siguiendo el mismo procedimiento anterior.

Técnica de Aislamiento de Escherichia coli BLEE Siembra en el medio TBX BIO-RAD® 3J1027 Procedimiento de siembra 

Cada dilución realizada se sembró en por extensión en placa de la siguiente manera:



Se tomó 100µl de la dilución 10-3 y se colocó en una caja Petri con agar TBX con Cefotaxima (TBX+C).



Se distribuyó todo el inóculo con el asa de Digralsky estéril realizando movimientos circulares a través de toda la caja. (Igual procedimiento se sigue con la dilución 10-2).



Se tomó 1000µl de la dilución 10-1 distribuida en dos cajas (500µl cada una).

37



Se distribuyó el inóculo con el asa de Digraslky estéril de la misma manera que las cajas anteriores.



Se colocó la segunda capa de medio TBX+C en cada una de las cajas por medio de la técnica de vertido en placa.

Gráfico 3. Descripción de la siembra en agar TBX+C.

Elaborado por: La autora

Incubación 

Se incubó las cajas Petri sembradas a 37°C por 24 horas.

Identificación morfológica de colonias 

Las colonias de Escherichia coli BLEE son puntiformes verde/azuladas (NRL, 2013).

Cuantificación 

Se seleccionó las cajas de cada muestra que contenían entre 15 y 200 colonias azuladas y se tomó el registro fotográfico cada una de ellas (NRL, 2013).

38



Se cuantificó las colonias y se registró los valores en hojas Excel (Ver anexo 4).

Técnica de crioconservación de cepas de Escherichia coli BLEE 

Se conservó dos colonias azuladas puntiformes aisladas.



Se sembró en 300µl de caldo Tripticasa Soya (TSB) contenido en un tubo Eppendorff®



Se incubó por 24 horas a 37°C.



Se adicionó 600µl glicerol estéril y se guardaron las cepas a -80°C.

Técnica de Procesamiento Los datos obtenidos de cada muestreo fueron registrados en Hojas de Microsoft Excel 2010®, así como también información sobre la ubicación, estado sanitario, edad, entre otros datos de las aves faenadas.

Análisis de datos La distribución normal de los datos obtenidos fue analizada con la prueba Shapiro – Wilk empleando el software IBM® SPSS ® STATISTICS, Versión 22. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) para comparar los resultados de cuantificación entre muestreos y entre puntos críticos de control, aplicando también la corrección de Bonferroni para el ajuste estadístico de las comparaciones realizadas. Para esto se empleó Microsoft Excel 2010®.

39

CAPÍTULO IV

RESULTADOS

Presentación de Resultados El aislamiento y cuantificación de E. coli BLEE se realizó en el medio TBX (Triptone Bile X-glucuronide Medium) suplementado con Cefotaxima. En el gráfico 4 se puede observar el crecimiento de colonias verde azuladas, puntiformes de Escherichia coli BLEE. Gráfico 4. Aislamiento de Escherichia coli productor de β - lactamasas de espectro extendido en el medio TBX +C.

Escherichia coli posee la enzima glucoronidasa que rompe el complejo cromogénico X- glucuródino presente en el agar TBX. La liberación del cromóforo da la coloración azul verdosa característica a las colonias. La peptona proporciona los nutrientes esenciales para el crecimiento de los microorganismos, mientras que las sales biliares inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas. La Cefotaxima es empleada como un agente selectivo al permitir el crecimiento de bacterias resistentes a β- lactámicos.

Fuente: Investigación Directa 40

Durante los seis meses de la investigación se tomó un total de 200 muestras de piel, 50 muestras de agua, y 10 muestras de ciegos (25 ciegos por cada muestra) en las plantas de faenamiento 1CT y 2CT.

Tabla 6. Número total de muestras procesadas durante la investigación. EMPRESA

Número de Muestreo 1 1CT 2 3 4 5 1 2CT 2 3 4 5 Número total de muestras

Número de Muestras Piel Agua Ciegos 20 6 1 20 6 1 20 6 1 20 6 1 20 6 1 20 4 1 20 4 1 20 4 1 20 4 1 20 4 1 200 50 10 Fuente: Investigación directa Elaboración: La Autora

Tabla 7. Características de la línea de faenamiento de cada una de las empresas. a

Velocidad de la línea Aturdimiento Promedio Temperatura Escaldado Tiempo de Escaldado Tiempo de Desplumado Duchas intermedias Número de Tanques de enfriamiento Temperatura de los tanques de Enfriamiento b a

Empresa 1CT 3000 Eléctrico 56,9°C 180 segundos 18 segundos Presentes 3

Empresa 2CT 3000 Eléctrico 52,9°C 150 segundos 25 segundos Presentes 2

Tanque 1: 21,6 Tanque 2: 16,85 Tanque 3: 7,75

Tanque 1: 25,13 Tanque 2: 2,08

Carcasas por hora , b Grados centígrados

Fuente: Investigación directa Elaboración: La Autora 41

En las siguientes tablas y gráficos se muestra el promedio, y desviación estándar de las muestras tomadas en cada empresa. Tabla 8. Promedio de UFC/g (Log10) de E. coli BLEE y Desviación Estándar por muestreo en empresas 1CT y 2CT. Punto de muestreo, Promedio* (Desviación Estándar)* # Muestreo 1CT

C**

1 2 3 4 5 Promedio 2CT 1 2 3 4 5 Promedio

P

E

A

W1

W2

W3

D

5,52

0,0

0,46(1,04)

0,29(0,66)

1,42(0,60)

1,65(0,07)

0,00

2,11(0,24)

4,78

2,01(0,27)

2,27(0,60)

0,26(0,58)

1,24(0,34)

2,50(2,12)

0,00

1,40(0,21)

5,76 6,53 6,43 5,80(0,64)

2,06(0,25) 1,32(0,82) 0,78(0,71) 1,23(0,91)

1,31(1,32) 1,03(0,94) 1,20(0,68) 1,25(1,05)

0,26(0,58) 1,89(1,35) 1,52(0,30) 0,98(1,01)

0,85(1,20) 0,50(0,71) 0,00(0,00) 0,80(0,74)

1,00(1,41) 1,93(0.89) 1,59(0,16) 1,73(1,03)

1,00(1,41) 2,09(0,27) 1,15(0,21) 0,84(0,96)

1,35(0,77) 1,80(0,24) 1,86(1,15) 1,70(0,65)

8,14 6,85 1,30 5,32 6,03 5,52(2,31)

3,07(0,13) 3,02(0,15) 2,84(0,38) 2,94(0,56) 2,37(0,26) 2,84(0,40)

3,62(0,09) 3,55(0,67) 3,24(0,28) 3,60(0,58) 2,90(0,58) 3,38(0,52)

3,50(0,19) 3,18(0,43) 2,97(0,76) 2,95(0,33) 2,36(0,46) 2,99(0,57)

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

-

2,55(0,69) 2,50(0,45) 1,89(0,25) 1,22(0,76) 1,29(0,81) 1,89(0,81)

C. Ciegos, P. Después del desplume, E. Eviscerado, A. Antes del Enfriamiento, W1. Tanque de enfriamiento 1, W2. Tanque de enfriamiento 2, W3. Tanque de enfriamiento 3, D. Después del enfriamiento. *Los valores están expresados en UFC/g Log10. **Una sola muestra, no aplica desviación estándar

Fuente: Investigación directa Elaboración: La Autora

42

Gráfico 5. Promedio de UFC/g (Log10) de Escherichia coli BLEE en cada punto muestreado en la empresa 1CT. 2,50

UFC/g (log10)

2,00

1,50

Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3

1,00

Muestreo 4 Muestreo 5

0,50

0,00 P

E

A

D

Puntos de Muestreo

P. Después del desplume, E. Eviscerado, A. Antes del Enfriamiento D. Después del Enfriamiento.

Fuente: Investigación directa Elaboración: La Autora

43

Gráfico 6. Promedio de UFC/g (Log10) de Escherichia coli BLEE en cada punto muestreado en la empresa 2CT. 4,00 3,50

UFC/g (log10)

3,00 2,50

Muestreo 1 Muestreo 2

2,00

Muestreo 3

1,50

Muestreo 4 Muestreo 5

1,00 0,50 0,00 P

E

A

D

Puntos de Muestreo

P. Después del desplume, E. Eviscerado, A. Antes del Enfriamiento D. Después del Enfriamiento.

Fuente: Investigación directa Elaboración: La Autora

44

Gráfico 7. Promedio y desviación estándar de UFC/g (Log10) de Escherichia coli BLEE en las empresas 1CT y 2CT. 4,50 4,00 3,50

UFC/g (Log10)

3,00 2,50 EMPRESA 1CT

2,00

EMPRESA 2CT

1,50 1,00 0,50 0,00 P -0,50

E

A

D

Puntos muestreados

P. Después del desplume, E. Eviscerado, A. Antes del Enfriamiento D. Después del Enfriamiento.

Fuente: Investigación directa Elaboración: La Autora

45

Tabla 9. Promedio de UFC/ml (Log10) de E. coli BLEE y ppm de Cloro de los tanques de Enfriamiento de las empresas 1CT y 2CT.

Empresa 1CT

2CT

Promedio*, (Cloro**) Pre-enfriamiento 1 Pre-enfriamiento 2 W1 W2 1,43 (0,30) 1,65 (0,30) 1,24 (1,00) 2,50 (0,00) 0,85 (0,00) 1,00 (0,00) 0,50 (0,15) 1,93 (0,00) 0,00 (0,60) 1,59 (0,25) 0,80 (0,41) 1,73 (0,11) 0,00 (20,0) 0,00 (19,0) 0,00 (17,0) 0,00 (17,5) 0,00 (16,2) 0,00 (20,0) 0,00 (16,5) 0,00 (19,0) 0,00 (17,2) 0,00 (20,0) 0,00 (17,1) 0,00 (19,1)

# de muestreo 1 2 3 4 5 PROMEDIO 1 2 3 4 5 PROMEDIO

*Los valores están expresados en UFC/g Log10.

Enfriamiento 3 W3 0,00 (0,30) 0,00 (0,00) 1,00 (0,00) 2,09 (0,00) 1,15 (0,05) 0,84 (0,07) -

**Los valores están expresados en ppm.

Fuente: Investigación directa Elaboración: La Autora

Gráfico 8. UFC/ml (Log10) de Escherichia coli BLE y ppm de cloro en los tanques de enfriamiento de la empresa 1CT.

2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

0,11

0,41

0,07

1,73

Cloro ppm UFC/g Log10

0,84

0,80

W1

W2

W3

Tanques de Enfriamiento

W1. Tanque de enfriamiento 1, W2. Tanque de enfriamiento 2, W3. Tanque de enfriamiento 3

Fuente: Investigación directa Elaboración: La Autora

46

Distribución Normal de datos Tabla 10. Prueba Shapiro - Wilk empresa 1CT y 2CT. 1CT Estadístico gl

2CT Estadístico gl

Punto de P valor* Muestreo P 0,816 25 0,000 E 0,858 25 0,002 A 0,836 25 0,001 D 0,832 25 0,001 gl. Grados de Libertad, *P valor (> 0,05)

0,963 0,954 0,987 0,939

25 25 25 25

P valor* 0,481 0,307 0,980 0,139

Fuente: Investigación directa Elaboración: La Autora La normalidad de los datos fue analizada con la prueba Shapiro – Wilk. Se consideró que los datos tuvieron una distribución normal si el P valor calculado fue mayor a 0,05. Como se observa en la Tabla 10, los datos de la empresa 1CT no presentaron una distribución normal (P valor < 0,05), por este motivo no se realizó el ANOVA propuesto en este estudio ya que la normalidad de los datos es un requisito previo para dicho análisis. Dado que los datos de la empresa 2CT sí presentaron una distribución normal (P valor >0,05), se procedió a realizar el análisis de varianza.

Análisis de Varianza Tabla 11. Análisis de varianza empresa 2CT. Grupos P E A D

Cuenta 25 25 25 25

Suma 71,16 84,55 74,8 47,26

Promedio 2,8464 3,382 2,992 1,8904

Varianza 0,16 0,27 0,33 0,66

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Origen de las variaciones

Suma de cuadrados

Entre grupos Dentro de los Grupos

30,07

Grados de libertad 3

34,54

96

Total

64,62

99

Promedio F Probabilidad de los cuadrados 10,02 27,86 0,000

Valor crítico para F 2,69

0,35

Fuente: Investigación directa Elaboración: La Autora

El análisis de Varianza de la empresa 2CT indica que existe una diferencia significativa entre los grupos analizados (Probabilidad < a 0,05), se realizó las correcciones de Bonferroni para ajustar los resultados estadísticos en las múltiples comparaciones que se efectuaron.

Las correcciones de Bonferroni se realizaron empleando la prueba t para dos colas muestras suponiendo varianzas iguales en Microsoft Excel®. Para esto se dividió el p- valor (0,05) para el número de comparaciones (6).

Se compara el valor P- Bonferroni con el valor de T a dos colas, si el primero es mayor se rechaza la hipótesis nula y existe diferencia.

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Correcciones de Bonferroni Tabla 12. Correcciones de Bonferroni empresa 2CT. Comparación Después del desplume: después de eviscerado Después del desplume: antes del enfriamiento Después del desplume: después del enfriamiento Después de Evisceración: antes del enfriamiento Después de Evisceración: después del enfriamiento Antes del enfriamiento: después del enfriamiento t valor p en la prueba t student a dos colas

Valor pt

Diferencia

0,000

Valor P- Bonferroni 0,008

0,305

0,008

No

0,000

0,008



0,016

0,008

No

0,000

0,008



0,000

0,008





Fuente: Investigación directa Elaboración: La Autora

Discusión En la presente investigación se aisló y cuantificó E. coli productor de β lactamasas de Espectro Extendido en diferentes etapas del proceso de faenamiento de pollos broiler en dos camales industriales de la Provincia de Pichincha. El promedio de contaminación de E. coli BLEE en ciegos fue de 5,80 UFC/g Log10 y 5,52 UFC/g Log10 en la empresa 1CT y 2CT respectivamente, esta carga bacteriana indicó la contaminación inicial de E. coli BLEE en las parvadas muestreadas. E. coli BLEE fue aislada en todas las muestras de ciegos tomadas (n=10), esto concuerda con estudios como el realizado en Alemania en donde se aisló E. coli BLEE en el 72,5% de los ciegos analizados (n=51) (Reich, Atanassova, & Günter, 2013). De la misma manera en Ecuador se encontró un 86,89% de positividad de E. coli BLEE en muestras de ciegos de pollos faenados en camales industriales de Pichincha (Vásconez Paucar, 2014).

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La normalidad de los datos fue analizada con la prueba Shapiro – Wilk. Los datos de la empresa 1CT no tuvieron una distribución normal por lo que no se pudo realizar el análisis de varianza propuesto en este estudio. Los datos de la empresa 2CT presentaron una distribución normal (Shapiro – Wilk > 0,05), se realizó el Análisis de varianza y se encontró diferencias significativas en todos los puntos excepto dos (P y A; E y A), por lo que los valores que a continuación se menciona pertenecen a esta empresa. Después del desplume los valores de E. coli BLEE disminuyeron respecto a la contaminación de ciegos, el valor fue 2,84 UFC/g Log10. De manera similar otro estudio reportó valores de E. coli de 2,24 UFC/g después del escaldado y desplumado (n=144) (Vaidya, Paturkar, Waskar, Zende, & Rawool, 2005).

Se ha demostrado que la temperatura del agua del escaldado y el tiempo de inmersión disminuye la carga bacteriana de las carcasas. Un estudio realizado en Grecia demostró que la tasa de disminución de E. coli durante el escaldado es mayor en los primeros 10 segundos de inmersión y sigue disminuyendo de manera constante hasta 150 segundos después de la inmersión a 42°C (Cason, Buhr, & Jr, 2006).

En el presente estudio la temperatura promedio de escaldado fue 52,9°C con un tiempo de inmersión de 150 segundos, lo que causaría la disminución de la carga bacteriana en este punto del proceso.

El punto en donde se registró una mayor carga bacteriana de E. coli BLEE fue en la evisceración con un valor de 3,38 UFC/g Log10. Esto concuerda con estudios realizados en la India y Argentina en donde las cargas bacterianas de E. coli en carcasas de pollo después del eviscerado fueron 3,07 UFC/g Log10 y 3,54 UFC/g Log10 respectivamente (Jiménez, Tiburzi, Salsi, Pirovani, & Moguilevsky, 2003; Vaidya et al., 2005).

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El aumento de la carga bacteriana en la evisceración puede darse por la ruptura del tracto gastrointestinal de las aves durante el proceso. Así, en Brasil se determinó que la mayor incidencia de contaminación en la línea de evisceración fue fecal y biliar lo que facilitaría la propagación de microorganismos de una canal a otra (Brizio, Marin, Schittler, & Prentice, 2015).

Antes del enfriamiento, el número de UFC de E. coli BLEE decreció de 3,38 a 2,99 UFC/g Log10, al igual que en una investigación realizada en Australia (n=240) en donde el conteo de E. coli disminuyó de 7,01 UFC/g Log10 a 6,9 UFC/g Log10 en este punto del faenamiento (Duffy, Blackall, Cobbold, & Fegan, 2014).

Esto se explicaría por la acción de las duchas intermedias que son empleadas para remover sólidos y contaminación fecal visible de las carcasas antes del enfriamiento. En Atenas se reportó la disminución de E. coli de 4,60 a 4,41 UFC/ml Log10 antes y después del lavado de las canales (Berrang & Bailey, 2009). En el presente estudio no hubo diferencia estadística entre la evisceración y antes del enfriamiento, lo que evidencia una falta de efectividad de las duchas presentes entre estos dos pasos sobre la carga bacteriana de las carcasas.

Después del enfriamiento la cantidad de E. coli BLEE disminuyó en 1,1 UFC/g Log10. La cantidad de cloro empleada fue 17,1 y 19,1 ppm en los tanques de enfriamiento 1 y 2 respectivamente. La disminución de la carga bacteriana puede atribuirse a la cantidad de cloro empleada en los tanques de enfriamiento, tal como lo demuestran un estudio realizado en la Universidad de Georgia en donde se reportó un decremento de 1,4 UFC/g Log10 de E. coli cuando se empleó 20 ± 2ppm de cloro en el agua de los tanques de enfriamiento (Northcutt, Berrang, Dickens, Fletcher, & Cox, 2003). E. coli BLEE fue aislado en el de agua de enfriamiento de la empresa 1CT en donde se registró 0,8; 1,7 y 0,8 UFC /ml Log10 en los tanques de enfriamiento 1, 2 y 3 correspondientemente. Los promedios de cloro en el agua fueron 0,41; 0,11 y 51

0,07ppm, en contraste con la empresa 2CT Los niveles bajos de cloro en la empresa 1CT no tendrían un efecto marcado en la disminución de la carga microbiana del agua utilizada para el enfriamiento lo que puede conducir a la contaminación cruzada y recontaminación de carcasas. Esto concuerda con el estudio realizado en Buenos Aires en donde se aisló E. coli Enteropatógena en el agua de enfriamiento de un camal de faenamiento de pollos broiler (Alonso, Padola, Parma, & Lucchesi, 2011).

Además se conoce que Escherichia coli crece a 7°C, y la temperatura mínima que alcanzó el tanque de enfriamiento 3 fue 7,75°C lo cual facilitaría la sobrevivencia de la bacteria en este punto (James, Vincent, de Andrade Lima, & James, 2006). Las diferencias reportadas se atribuyen a las características propias de la empresa, varias investigaciones demuestran la variabilidad en la carga bacteriana en diferentes procesos de faenamiento (Cibin et al., 2014; Seliwiorstow, Baré, Van Damme, Uyttendaele, & De Zutter, 2015). De nuestro conocimiento, el presente estudio es la primera investigación en la que se reporta la contaminación de E. coli BLEE en la piel de pollo, recolectadas en puntos críticos durante el faenamiento en Ecuador. Los resultados muestran que la carga bacteriana

persiste en el pollo aun después de las duchas y del

enfriamiento, lo que indica que las empresas deben mejorar sus procesos de evisceración, lavado y enfriamiento con el propósito de disminuir la cantidad de E. coli BLEE y otros microorganismos potencialmente patógenos para los seres humanos.

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CAPÍTULO V CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES Conclusiones 1. La cuantificación de E. coli productor de β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) en la empresa 1CT y 2CT se realizó mediante la técnica de cuantificación de diluciones decimales.

2. Los datos de cuantificación de E. coli BLEE

de la empresa 1CT

no

tuvieron una distribución normal, lo que indica una falta de uniformidad entre los procesos de faenamiento. 3. El valor cuantificado de E. coli BLEE en la evisceración fue 3,38 UFC/g Log10 siendo este el punto en donde se registró una mayor carga bacteriana de las carcasas en la empresa 2CT.

4. La cuantificación de Escherichia coli BLEE demostró que la carga bacteriana no disminuye después del lavado de las carcasas en la empresa 2CT. 5. Los niveles de cloro (17,1 y 19,1 ppm) utilizados en el agua durante el enfriamiento de las carcasas en la empresa 2CT ejercen un efecto importante en la disminución de la carga bacteriana.

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Recomendaciones

1. La evisceración es un punto susceptible a ser mejorado debido al incremento en la carga bacteriana registrada en este punto.

2. Se debería mejorar el proceso de lavado de las carcasas cerciorándose de que las duchas presentes después de la evisceración ejerzan una disminución en la carga bacteriana. 3. Se recomienda investigar la presencia de E. coli productor de β- lactamasas de espectro extendido en el producto en percha con el propósito de evaluar el riesgo que representan para la población.

4. Se debería investigar los genes de resistencia presentes en las cepas coleccionadas durante la presente investigación para conocer los genes de mayor prevalencia.

5. Mantener medidas de higiene cuando se manipule la carne de pollo para evitar la contaminación cruzada.

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65

LISTADO DE ABREVIATURAS A: antes del enfriamiento. AmpC: Serin Betalactamasa. Aw: actividad mínima de agua BLEE: Betalactamasa de espectro extendido. C: ciegos. CDC: Centro para el control y prevención de enfermedades (del inglés, Centre for Disease Control and Prevention). CONAVE: Corporación Nacional de Avicultores del Ecuador. D: después del enfriamiento. E: después del eviscerado. EFSA: Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (del inglés, European Food Safety Autorithy). FAO: Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (del inglés, Food and Agriculture Organization of the United Nations). HACCP: Análisis de peligros y puntos críticos de control (del inglés, Hazard analysis and critical control points). Log10: Logaritmo de base 10. NRL: Laboratorio Nacional de Referencia (del inglés, National Reference Laboratory) P: Después del desplume. ppm: Partes por Millón.

66

TBX: Agar Triptona Bilis X- Glucurónido (del inglés, Tryptone Bile Agar XGlucuronide). UFC: Unidades Formadoras de Colonia. USDA: Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (del inglés, United States Department of Agriculture). W: agua WHO: Organización Mundial de la Salud (del inglés, World Health Organization).

67

ANEXOS

68

Anexo 1. Esquema de aislamiento de E. coli BLEE.

69

Anexo 2. Crioconservación de cepas de Escherichia coli BLEE

Colonia de Escherichia coli BLEE sembrada en 300 µl de caldo Tripticasa Soya (TSB)

Colección de cepas de Escherichia coli BLEE crioconservadas a -80°C.

70

Anexo 3. Tabla de registro de información de las parvadas muestreadas. Granja Fecha muestreo en granja Fecha muestreo en camal Ubicación Lote Número de galpones de la granja Galpón Edad al faenamiento (días) AB incubadora AB recepción Promotores en alimento AB Tratamientos 1 AB Tratamientos 2 AB Tratamientos 3 Enfermedades con diagnóstico clínico Observaciones

71

Anexo 4. Tabla de registro de registro de resultados de cuantificación de Escherichia coli BLEE.

Número dilución

Log

TBX+C Cepas -80°C

Observaciones

1 P

2 3 4 5 1

E

A

W

2 3 4 5 1 2 3 4 5 W1a W1b W2a W2b W3a W3b

D

1 2 3 4 5

C

72

Anexo 5. Preparación del Agar TBX+C y del Caldo TSB. AGAR TBX 

Disolver 33,6 gramos del medio en 1 litro de agua destilada.



Mezclar hasta obtener una suspensión homogénea.



Calentar lentamente agitando con frecuencia hasta llegar a ebullición para la disolución completa.



Esterilizar por autoclave a 121°C durante 15 minutos.



Diluir 3mg de Cefotaxima en 1500µl de agua destilada estéril, colocar la dilución en un litro de agar TBX cuando tenga una temperatura por debajo de los 50°C.



Dispensar aproximadamente 12ml de agar en cajas Petri desechables.

CALDO TSB 

Disolver 30 gramos del medio en 1 litro de agua destilada.



Mezclar hasta obtener una suspensión homogénea.



Calentar lentamente agitando con frecuencia hasta llegar a ebullición para la disolución completa.



Esterilizar por autoclave a 121°C durante 15 minutos.

73

Anexo 6. Promedio, Varianza, Desviación estándar y Coeficiente de Variación de E. coli BLEE (Log10/g) por muestreo en la empresa 1CT. MUESTREO 1 Ciegos

1 2 3 4 5 PROMEDIO VARIANZA DESVIACIÓN COEFICIENTE

C 5,52 5,52 5,52 5,52 5,52 5,52 0,00 0,00 0,00

Desplume Eviscerado P 0 0 0 0 0 0,00 0,00 0,00 -

E 0 2,32 0 0 0 0,46 1,08 1,04 223,61

Antes de Chilling A 0 1,48 0 0 0 0,30 0,44 0,66 223,61

Agua 1 W1 1 1,85

Agua 2 W2 1,6 1,7

Agua 3 W3 0 0

1,43 0,36 0,60 42,18

1,65 0,00 0,07 4,29

0,00 0,00 0,00 -

Final D 2,15 2,32 2,18 1,7 2,2 2,11 0,06 0,24 11,29

Tomado de: Investigación directa Elaboración: La Autora

MUESTREO 2 Ciegos Desplume Eviscerado

1 2 3 4 5 PROMEDIO VARIANZA DESVIACIÓN COEFICIENTE

C 4,78 4,78 4,78 4,78 4,78 4,78 0,00 0,00 0,00

P 1,7 2,23 2,04 1,78 2,3 2,01 0,07 0,27 13,22

E 3 2,79 1,6 1,85 2,15 2,28 0,36 0,60 26,36

Antes de Chilling A 0 0 0 1,3 0 0,26 0,34 0,58 223,61

Agua 1 W1 1 1,48

Agua 2 W2 1 4

Agua 3 W3 0 0

1,24 0,12 0,34 27,37

2,50 4,50 2,12 84,85

0,00 0,00 0,00 -

Tomado de: Investigación directa Elaboración: La Autora

74

Final D 1,3 1,3 1,3 1,3 1,78 1,40 0,05 0,21 15,38

MUESTREO 3 Ciegos Desplume Eviscerado

1 2 3 4 5 PROMEDIO VARIANZA DESVIACIÓN COEFICIENTE

C 5,76 5,76 5,76 5,76 5,76 5,76 0,00 0,00 0,00

P 2,38 1,85 2,11 1,78 2,18 2,06 0,06 0,25 11,94

E 1,3 0 2,77 2,48 0 1,31 1,73 1,32 100,50

Antes de Chilling A 0 0 0 1,3 0 0,26 0,34 0,58 223,61

Agua 1 W1 1,7 0

Agua 2 W2 2 0

Agua 3 W3 0 2

Final

D 1,48 1,6 1,78 0 1,9 0,85 1,00 1,00 1,35 1,45 2,00 2,00 0,60 1,20 1,41 1,41 0,77 141,42 141,42 141,42 57,16

Tomado de: Investigación directa Elaboración: La Autora

MUESTREO 4 Ciegos Desplume Eviscerado

1 2 3 4 5 PROMEDIO VARIANZA DESVIACIÓN COEFICIENTE

C 6,53 6,53 6,53 6,53 6,53 6,53 0,00 0,00 0,00

P 1,3 1,3 2,08 1,9 0 1,32 0,66 0,82 61,93

E 1,6 0 1,78 1,78 0 1,03 0,89 0,94 91,56

Antes de Chilling A 2,8 1,3 0 1,85 3,49 1,89 1,83 1,35 71,60

Agua 1 W1 0 1

Agua Agua 2 3 W2 W3 1,3 1,9 2,56 2,28

0,50 1,93 2,09 0,50 0,79 0,07 0,71 0,89 0,27 141,42 46,16 12,86

Tomado de: Investigación directa Elaboración: La Autora

75

Final D 1,6 1,6 2,18 1,85 1,78 1,80 0,06 0,24 13,23

MUESTREO 5 Ciegos Desplume Eviscerado

1 2 3 4 5 PROMEDIO VARIANZA DESVIACIÓN COEFICIENTE

C 6,43 6,43 6,43 6,43 6,43 6,43 0,00 0,00 0,00

P 0 1,3 1,3 1,3 0 0,78 0,51 0,71 91,29

E 1,6 1,6 1,3 0 1,48 1,20 0,46 0,68 56,84

Antes de Chilling A 1,3 1,78 1,9 1,3 1,3 1,52 0,09 0,30 19,71

Agua 1 W1 0 0

Agua Agua 2 3 W2 W3 1,7 1 1,48 1,3

0,00 0,00 0,00 0,00

1,59 0,02 0,16 9,78

1,15 0,05 0,21 18,45

Final D 3,91 1,3 1,3 1,48 1,3 1,86 1,32 1,15 61,88

Tomado de: Investigación directa Elaboración: La Autora

Anexo 7. Promedio, Varianza, Desviación estándar y Coeficiente de Variación de E. coli BLEE (Log10/g) por muestreo en la empresa 2CT. .

MUESTREO 1 Ciegos Desplume

1 2 3 4 5 PROMEDIO VARIANZA DESVIACIÓN COEFICIENTE

C 8,14 8,14 8,14 8,14 8,14 8,14 0,00 0,00 0,00

P 3,02 3,03 3,14 2,9 3,25 3,07 0,02 0,13 4,32

Eviscerado E 3,66 3,49 3,64 3,72 3,57 3,62 0,01 0,09 2,45

Antes de Chilling A 3,8 3,51 3,48 3,44 3,29 3,50 0,03 0,19 5,30

Agua 1

Agua 2

Final

W1 0 0

W2 0 0

0,00 0,00 0,00 -

0,00 0,00 0,00 -

D 2,32 2,86 2,32 1,7 3,54 2,55 0,48 0,69 27,08

Tomado de: Investigación directa Elaboración: La Autora

76

MUESTREO 2

1 2 3 4 5 PROMEDIO VARIANZA DESVIACIÓN COEFICIENTE

Ciegos

Desplume

Eviscerado

C 6,85 6,85 6,85 6,85 6,85 6,85 0,00 0,00 0,00

P 3,12 2,9 2,86 3,21 3,02 3,02 0,02 0,15 4,85

E 3,51 3,28 4,71 3,06 3,2 3,55 0,45 0,67 18,79

Antes de Chilling A 2,91 3,89 3,26 2,96 2,86 3,18 0,18 0,43 13,49

Agua 1

Agua 2

Final

W1 2,18 0

W2 0 0

1,09 2,38 1,54 141,42

0,00 0,00 0,00 -

D 2,81 2,41 2,15 2,04 3,11 2,50 0,20 0,45 17,97

Tomado de: Investigación directa Elaboración: La Autora

Muestreo 3 Ciegos Desplume Eviscerado

1 2 3 4 5 PROMEDIO VARIANZA DESVIACIÓN COEFICIENTE

C 1,3 1,3 1,3 1,3 1,3 1,30 0,00 0,00 0,00

P 2,41 2,61 3,41 2,85 2,9 2,84 0,14 0,38 13,27

E 3,39 3,44 3,11 2,81 3,46 3,24 0,08 0,28 8,62

Antes de Chilling A 2,68 2,45 2,8 4,31 2,59 2,97 0,58 0,76 25,70

Agua 1

Agua 2

Final

W1 0 0

W2 0 0

0,00 0,00 0,00 -

0,00 0,00 0,00 -

D 1,9 2,04 1,7 2,23 1,6 1,89 0,06 0,25 13,42

Tomado de: Investigación directa Elaboración: La Autora

77

MUESTREO 4 Ciegos Desplume Eviscerado

1 2 3 4 5 PROMEDIO VARIANZA DESVIACIÓN COEFICIENTE

C 5,32 5,32 5,32 5,32 5,32 5,32 0,00 0,00 0,00

P 2,08 2,79 3,07 3,61 3,15 2,94 0,32 0,56 19,18

E 3,31 3,81 4,5 3 3,36 3,60 0,34 0,58 16,19

Antes de Chilling A 3,03 3,23 3,18 2,4 2,93 2,95 0,11 0,33 11,23

Agua 1

Agua 2

Final

W1 0 0

W2 0 0

0,00 0,00 0,00 -

0,00 0,00 0,00 -

D 1,9 1,7 0 1 1,48 1,22 0,57 0,76 62,32

Tomado de: Investigación directa Elaboración: La Autora

MUESTREO 5 Ciegos Desplume

1 2 3 4 5 PROMEDIO VARIANZA DESVIACIÓN COEFICIENTE

C 6,03 6,03 6,03 6,03 6,03 6,03 0,00 0,00 0,00

P 2,59 2,18 2,58 2,48 2 2,37 0,07 0,26 11,13

Eviscerado E 2,51 2,56 2,78 3,92 2,75 2,90 0,34 0,58 19,97

Antes de Chilling A 2,74 2,88 1,95 1,85 2,38 2,36 0,21 0,46 19,46

Agua 1

Agua 2

Final

W1 0 0

W2 0 0

0,00 0,00 0,00 -

0,00 0,00 0,00 -

D 1,9 1,85 1 0 1,7 1,29 0,65 0,81 62,52

Tomado de: Investigación directa Elaboración: La Autora

78

Anexo 8. Promedio y Desviación Estándar de UFC (Log10/g) de E. coli BLEE empresa 1CT. #Muestreo 1

2

3

4

5

Promedio SD

P 0 0 0 0 0 1,7 2,23 2,04 1,78 2,3 2,38 1,85 2,11 1,78 2,18 1,3 1,3 2,08 1,9 0 0 1,3 1,3 1,3 0 1,233 0,919

E 0 2,32 0 0 0 3 2,79 1,6 1,85 2,15 1,3 0 2,77 2,48 0 1,6 0 1,78 1,78 0 1,6 1,6 1,3 0 1,48 1,256 1,055

Punto de Muestreo 1CT A W1 0 1 1,48 1,85 0 0 0 0 1 0 1,48 0 1,3 0 1,6 1,7 0 0 1,3 2,04 0 2,8 0 1,3 1 0 1,85 3,49 1,3 0 1,78 0 1,9 1,3 1,3 0,989 0,803 1,016 0,749

W2 1,6 1,7

W3 0 0

1 4

0 0

2 0

0 2

1,3 2,56

1,9 2,28

1,7 1,48

1 1,3

1,734 1,038

0,848 0,960

D 2,15 2,32 2,18 1,7 2,2 1,3 1,3 1,3 1,3 1,78 1,48 1,6 1,78 0 1,9 1,6 1,6 2,18 1,85 1,78 3,91 1,3 1,3 1,48 1,3 1,703 0,658

Tomado de: Investigación directa Elaboración: La Autora

79

Anexo 9. Promedio y Desviación Estándar de UFC (Log10/g) de E. coli BLEE empresa 2CT. #Muestreo 1

2

3

4

5

Promedio SD

P 3,02 3,03 3,14 2,9 3,25 3,12 2,9 2,86 3,21 3,02 2,41 2,61 3,41 2,85 2,9 2,08 2,79 3,07 3,61 3,15 2,59 2,18 2,58 2,48 2 2,846 0,401

Punto de Muestreo 2CT E A 3,66 3,8 3,49 3,51 3,64 3,48 3,72 3,44 3,57 3,29 3,51 2,91 3,28 3,89 4,71 3,26 3,06 2,96 3,2 2,86 3,39 2,68 3,44 2,45 3,11 2,8 2,81 4,31 3,46 2,59 3,31 3,03 3,81 3,23 4,5 3,18 3 2,4 3,36 2,93 2,51 2,74 2,56 2,88 2,78 1,95 3,92 1,85 2,75 2,38 3,382 2,992 0,528 0,576

W1 0

W2 0

0

0

0

0

0

0

0

0

0 0

0 0

D 2,32 2,86 2,32 1,7 3,54 2,81 2,41 2,15 2,04 3,11 1,9 2,04 1,7 2,23 1,6 1,9 1,7 0 1 1,48 1,9 1,85 1 0 1,7 1,890 0,816

Tomado de: Investigación directa Elaboración: La Autora

80