Tesis - Universidad de Colima

Coordinador de Bioinformática, División de Disciplinas Básicas. Centro Universitario de Ciencias de la Salud, Universidad de Guadalajara. A los colaboradores.
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UNIVERSIDAD DE COLIMA

FACULTAD DE MEDICINA TRATAMIENTO FARMACOLÓGICO PRENATAL EN UN MODELO EXPERIMENTAL DE HERNIA DIAFRAGMÁTICA CONGÉNITA

Para obtener el grado de Doctor en Ciencias Médicas PRESENTA M. en C. María de Lourdes Lemus Varela

ASESOR BÁSICO Dr. en C. Guillermo M. Zúñiga González Centro de Investigación Biomédica de Occidente Instituto Mexicano del Seguro Social

ASESOR CLÍNICO Dr. en C. Valery Melnikov Universidad de Colima Colima, Colima, enero del 2009

II

AGRADECIMIENTOS Al Doctorado en Ciencias Médicas Universidad de Colima

Al Laboratorio de Mutagénesis Centro de Investigación Biomédica de Occidente

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) Becario número: 219418

Al Instituto Mexicano del Seguro Social

Al Fondo de Fomento a la Investigación (FOFOI) Financiamiento Institucional: 2006/1A/I/031

Al Miami Children’s Hospital & Sheridan Health Corporation Grants 2007 y 2008

Al Ing. Rogelio Troyo Sanromán Coordinador de Bioinformática, División de Disciplinas Básicas Centro Universitario de Ciencias de la Salud, Universidad de Guadalajara

A los colaboradores Dra. en C. Belinda Gómez Meda Dra. en C. Ana Lourdes Zamora Perez M. en C. Juan Manuel Ornelas Aguirre M. E. Amed Soliz

III

PRODUCTOS GENERADOS

Distinciones El presente trabajo fue presentado en formato oral el 20 de septiembre del 2008, en el V Congreso Iberoamericano de Neonatología – SIBEN y obtuvo el segundo lugar en la categoría de trabajos experimentales.

Premio:

Segundo

lugar

en

trabajos

experimentales

en

un

Congreso

Internacional.

IV

~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

Resumen del V Congreso Anual SIBEN ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ Greetings! Hace pocos días finalizó el V Congreso anual de SIBEN en Mar del Plata, Argentina. Es un placer como presidente de la Junta compartir una síntesis de algunos sucesos de trascendencia ocurridos en el mismo: El esfuerzo del grupo organizador ha sido recompensado en creces por la convocatoria lograda: el número alcanzado de 1490 asistentes inscriptos, representando a 30 países, superó nuestras expectativas. Fueron presentados y discutidos 171 trabajos científicos: 47 en forma oral, y el resto en pósters. Autores de nueve de estos trabajos fueron premiados por SIBEN: Primer y segundo premio al mejor trabajo experimental: Dra. Marta Rogido (USA) y Dra. María de Lourdes Lemus Varela (México) respectivamente; premio a la mejor presentación oral: Dr. Dan Waisman (Israel); primer y segundo premio al mejor trabajo clínico epidemiológico: Dra. Galviz Clara (Colombia) y Dr. Gustavo Rivara Dávila (Perú) respectivamente; Premio al mejor trabajo en sesión oral de póster: Dra. Lucrecia Bossi (Argentina); primer y segundo premio póster: Dr. José Rodríguez Pérez (Brasil) y Dra. Verónica Favareto (Argentina) y premio para mejor diseño póster Dra. Yolanda Pérez Saldeño (España). SIBEN se enriqueció con dos nuevos miembros de honor. Durante este Congreso recibieron el reconocimiento por sus trayectorias y aportes a la neonatología, los profesores Enzo Dueñas de Cuba y Roderic Phibbs de USA. Este año se realizó la reunión de Consenso Clínico en relación a Manejo Hemodinámico en el Recién Nacido. En el mismo hubo 45 participantes de 17 países. Se trabajó en la idea de elaborar en consenso una guía y recomendaciones de todos los temas de relevancia clínica relacionados a hemodinamia neonatal para luego publicarlo y darle amplia difusión en el futuro. Con base en reuniones anuales previas, este Congreso ha resultado en el continuo crecimiento de nuestra Sociedad. Como presidente de la Junta me enorgullezco en compartir este logro que es de todos. Un saludo muy cordial, con gratitud Dr Augusto Sola Presidente de SIBEN Octubre 2008. V

Presentación en formato cartel en el XIV Foro de Investigación en Salud del Instituto Mexicano del Seguro Social, que se llevo a cabo del 28 al 30 de mayo del 2008 en Bahía de San Carlos, Sonora.

Constancia de presentación en el XIV Foro Norte IMSS, Bahía de San Carlos, Sonora.

VI

Presentación en el Congreso Internacional de Investigación Pediátrica: Pediatric Academic Societies & Society for Pediatric Research, que se llevó a cabo del 2 al 6 de mayo del 2008 en Honolulu, Hawaii, USA. Se presentó en formato cartel el 5 de mayo:

Author Listing for "Lemus-Varela"

[5848.7] Antenatal Pharmacology Treatment in Rats with Congenital Diaphragmatic Hernia Authors: Lourdes M. Lemus-Varela, Belinda C. Gomez-Meda, Ana L. Zamora-Perez, Jose M. Ornelas-Aguirre, Barry Chandler, Soliz Amed, Valery Melnikov, Guillermo M. Zuniga-Gonzalez. First author is a Ph.D student. Date: Monday, May 5, 2008 Session Info: Poster Session: Neonatology (3:00 PM - 6:45 PM) Presentation Time: 03:00 PM Room: Halls A-C Board Number: 682

VII

ÍNDICE

Página RESUMEN

1

SUMMARY

2

INTRODUCCIÓN

3



Prevalencia y etiología

4



Embriología y patogénesis

5



Diagnóstico prenatal

9



Pronóstico

10



Terapeútica fetal

11

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

16

JUSTIFICACIÓN

18

OBJETIVOS

20

HIPÓTESIS

21

MATERIAL Y MÉTODOS

22



Diseño del estudio y modelo experimental

22



Intervención farmacológica prenatal

22



Cesárea y preparación de tejido pulmonar

23



Evaluación patológica

24



Cálculo de muestra

26



Consideraciones éticas y análisis estadístico

28



Operacionalización de variables

29

RESULTADOS

30

DISCUSIÓN

44

CONCLUSIONES

48

PERSPECTIVAS

49

ANEXOS

51

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

55

VIII

ÍNDICE DE CUADROS Y FIGURAS

CUADROS

Página

Cuadro 1. Etapas de desarrollo pulmonar.

8

Cuadro 2. Relación peso bloque cardiopulmonar/peso corporal

31

y dimensiones pulmonares en grupo control negativo (placebo) y grupo control positivo (nitrofén). Cuadro 3. Relación pared/luz arterial grupo 2 ó nitrofén versus

36

grupo 3 ó nitrofén + sildenafil. Cuadro 4. Fibrosis intersticial en el grupo 2 ó nitrofén versus

38

grupo 4 ó nitrofén + bosentán. Cuadro 5. Relación pared/luz arterial grupo 2 ó nitrofén versus

40

grupo 5 ó nitrofén + sildenafil + bosentán. FIGURAS Figura 1. Esquematización de la Hernia Diafragmática

3

Congénita. Figura 2. Etapas sucesivas del desarrollo del tabique

5

traqueoesofágico. Figura 3. Remodelación vascular pulmonar.

7

Figura 4. Diagnóstico prenatal de Hernia Diafragmática

9

Congénita. Figura 5. Oclusión traqueal endoluminal fetal.

12

Figura 6. Fotografías representativas de la metodología.

23

Figura 7. Fotografías representativas de hipoplasia pulmonar.

30

IX

Figura 8. Espesor de la pared arterial en el grupo

control

32

Figura 9. Conteo alveolar radial en el grupo control negativo o

33

negativo o placebo y control positivo o nitrofén.

placebo y grupo control positivo o nitrofén. Figura 10. Bronquiolos terminales en grupo control negativo o

34

placebo y control positivo o nitrofén. Figura 11. Espesor de la pared arterial en grupo 2 ó nitrofén

35

versus grupo 3 ó nitrofén + sildenafil. Figura 12. Bronquiolos terminales en el grupo 2 ó nitrofén

37

versus grupo 4 ó nitrofén + bosentán. Figura 13. Bronquiolos terminales en el grupo 2 ó nitrofén

38

versus grupo 5 ó nitrofén + sildenafil + bosentán. Figura 14. Espesor de la pared arterial en grupo 2 ó nitrofén

39

versus grupo 5 ó nitrofén + sildenafil + bosentán. Figura 15. Conteo alveolar radial en los grupos de estudio.

41

Figura 16. Intersepto linear medio en los grupos de estudio.

42

X

RESUMEN Titulo. Tratamiento farmacológico prenatal en un modelo experimental de Hernia Diafragmática Congénita (HDC). Introducción. La hipoplasia pulmonar y la Hipertensión Pulmonar Persistente, son los principales factores que limitan la sobrevida en la HDC. Objetivo. Determinar si la administración prenatal de sildenafil y/o bosentán, atenúa la

remodelación

vascular,

promueve

ramificación

bronquial

y

favorece

la

alveologénesis en un modelo experimental de HDC. Material y Métodos. Estudio experimental, aleatorizado y cegado. Mediante la administración de nitrofén a ratas Wistar gestantes, se indujo HDC en las crías, las ratas gestantes se distribuyeron en 5 grupos al azar: 1) control; 2) nitrofén; 3) nitrofén+sildenafil; 4) nitrofén+bosentán y 5) nitrofén+sildenafil+bosentán. En el día postconcepcional (DPC) 9 se administró, mediante sonda orogástrica, 100 mg de nitrofén para inducir HDC, mientras que el sildenafil a 100 mg/Kg/día y el bosentán a 30 mg/Kg/día, se administraron vía oral en los DPC 16 a 20. Resultados. Las crías que desarrollaron HDC presentaron grave hipoplasia pulmonar (relación peso bloque cardiopulmonar/peso corporal: 0.0261±0.0028 contra 0.0393±0.0054 en los controles) (p=0.0001); el grupo 3 (sildenafil) mostró disminución significativa en la muscularización vascular (3.2±0.75µ contra 4.5±0.67µ del grupo 2: nitrofén) (p=0.001), consecuentemente mejoró la relación pared/luz arterial (p=0.03). En el grupo 4 (bosentán) se encontró incremento significativo (p=0.002) de bronquiolos terminales (12.9±3.4 contra 8.2±1.7 del grupo 2: nitrofén). Igualmente, en el grupo 5 (nitrofén+sildenafil+bosentán), se encontró incremento significativo en los bronquiolos terminales (13.5±2.2 contra 8.2±1.7 del grupo 2) (p=0.0001) y disminución en el espesor de la pared arterial. Conclusiones. El tratamiento prenatal con sildenafil atenúa la remodelación vascular, mientras que el bosentán promueve el desarrollo de bronquiolos terminales, en HDC inducida por nitrofén.

1

SUMMARY Title. Antenatal pharmacology treatment in rats with Congenital Diafhragmatic Hernia (CDH). Background. Lung hipoplasia, Pulmonary Persistent Hypertension of the Newborn and it´s morphological changes are the main features in CDH, pathology with high morbility and mortality. Objective. To determine if antenatal sildenafil and/or bosentan attenuates vascular remodeling, promotes branching and improve alveologenesis, in experimental CDH. Design/Methods. Experimental trial randomized and blinded. Nitrofen (100 mg) was gavaged to pregnant rats at day post-conception (DPC) 9, to induce CDH and were randomized to 5 groups: 1) control; 2) nitrofen; 3) nitrofen+sildenafil 100 mg/Kg/day DPC 16 to 20; 4) nitrofen+bosentan 30mg/Kg/day, DPC 16 to 20 and 5) nitrofen+bosentan+sildenafil, the same doses and administration days. Results. The offspring with CDH was characterized by severe lung hypoplasia (lung weight to body weight ratio: 0.0261±0.0028 in nitrofen group versus 0.0393±0.0054 in controls (p=0.0001). In nitrofen+sildenafil group, decreased pulmonary arterial wall thickness, 3.2±0.75µ versus 4.5±0.67µ in nitrofen group (p=0.02). Nitrofen+bosentan group increased terminal bronchioles 12.9±3.4 versus 8.2±1.7 in nitrofen group (p=0.002).

Nitrofen+sildenafil+bosentán

group,

showed

significant

differences

(p=0.0001) in terminal bronchioles, 13.5±2.2 contra 8.2±1.7 in nitrofen group, also decresead pulmonary arterial wall thickness. Conclusion. Antenatal treatment with sildenafil attenuates vascular remodeling, bosentan promotes terminal bronchioles development in experimental CDH in rats.

2

INTRODUCCIÓN La Hernia Diafragmática Congénita (HDC) es una de las malformaciones más graves, es consecuencia del desarrollo anormal del diafragma fetal, lo cual permite que las vísceras abdominales invadan la cavidad torácica e interfieran con el adecuado desarrollo pulmonar (Figura 1), principalmente produce hipoplasia pulmonar que se caracteriza por disminución en el número de vías aéreas, acompañada de disminución también en el número de vasos, con incremento en la adventicia y media de la pared de los mismos lo cual resulta en Hipertensión Pulmonar Persistente, muchas veces intratable, esto explica la elevada morbilidad y mortalidad que se asocian a esta grave patología 1-3.

A

Hernia Diafragmática Congénita

B

Figura 1. Esquematización de la Hernia Diafragmática Congénita Figura 1A: Se muestra situación anatómica anormal del intestino delgado en cavidad torácica, lo cual interrumpe el correcto desarrollo pulmonar (hipoplasia pulmonar); 1B: se observa en la radiografía póstero-anterior de tórax, presencia de asas intestinales dentro de cavidad tóracica y evidente rechazo pulmonar y de estructuras mediastinales. Tomado de: 1A: Sucheston & Cannon. Congenital Malformations. Davis Co., Philadelphia. 1973. 1B: archivo fotográfico personal.

3

Prevalencia y Etiología La HDC ocurre en 1 de 2,500 nacidos vivos

4

y afecta aproximadamente a 1,100

recién nacidos por año en Estados Unidos de Norteamérica 5. La etiología de la HDC es pobremente comprendida, si bien es una condición que se presenta usualmente de manera esporádica, en 5 a 10 % de los casos es posible documentar etiología cromosómica, especialmente aneuploidías y alrededor del 50% de los fetos afectados se asocian con otras anormalidades cromosómicas no pulmonares, principalmente trisomía 18, trisomía 13, Síndrome Pallister-Killian, tetrasomía 12p por mosaicismo, además pueden presentarse otras alteraciones como defectos craneoespinales, cardiopatías y otros síndromes, tales como el Síndrome de Fryns, Síndrome de Lange y Síndrome de Marfan 6-8. Reportes recientes de la literatura informan que el Sistema Retinoide está involucrado en la etiología de la HDC

9

, ya que se han encontrado niveles

plasmáticos significativamente bajos de retinol en madres cuyos recién nacidos presentaron HDC, comparativamente con aquellas madres de recién nacidos sanos. Aparentemente se debe a disminución en la expresión de la enzima _iogénicos_ada2-retinal, necesaria para convertir el retinaldehído en ácido retinoico, el cual desempeña un papel importante en el desarrollo del precursor diafragmático conocido como pliegue pleuroperitoneal 10. Se ha descrito que la interrupción en la señalización del ácido retinoico, durante el desarrollo embriológico temprano, ocasiona anormalidades graves en el tracto respiratorio, incluida la agenesia pulmonar; estudios previos sugieren que podría deberse a falla selectiva para inducir crecimiento de fibroblastos, se ha demostrado disminución en la expresión del factor 10 de crecimiento de fibroblastos, (Fgf-10, por sus siglas en inglés: Fibroblast growth factor-10), en el área de las células del intestino anterior, que al invaginarse dará lugar a una pequeña yema de tejido endodérmico, a partir de la cual se formaran los pulmones 11. Ackerman y su grupo han establecido que una mutación en el gen Fog2 (por sus siglas en inglés: Friend of gata 2) causa anormalidades en el desarrollo diafragmático y pulmones pequeños, tanto en humano como en modelo experimental 12.

4

Embriología y Patogénesis El desarrollo embriológico del diafragma se completa en la semana 9 de gestación, en presencia de alteraciones en este desarrollo, la herniación de las vísceras abdominales ocurre entre las 10 y 12 semanas de gestación, cuando el intestino normalmente debe retornar a la cavidad abdominal. El desarrollo embriológico del diafragma y del pulmón está interrelacionado. El epitelio del pulmón y de la vía aérea, se desarrolla originalmente como dos brotes pequeños de células intestinales endodérmicamente derivadas, mientras que el resto del intestino se separa longitudinalmente en esófago y tráquea (Tabique traqueoesofágico) 13 (Figura 2).

Figura 2. Etapas sucesivas del desarrollo del tabique traqueoesofágico. Figura 2A, B y C: Muestran vistas laterales de la parte caudal de la faringe primitiva, se observa el divertículo laringotraqueal y la división del intestino anterior en el tubo esofágico y laringotraqueal. 2D, E y F: Cortes transversales que ilustran la formación del tabique traqueoesofágico y la separación del intestino anterior en tubo laringotraqueal y esófago. Tomado de: Moore & Persaud. Embriología Clínica. 7ª ed. Mc Graw Hill Philadelphia. 2004.

5

La morfogénesis bronquial está en coordinación con el desarrollo vascular, inicia con una estructura que semeja las ramas de un árbol, de componentes tubulares epiteliales, que se forma y diferencia para producir las vías aéreas y los alvéolos; en la regulación de estados iniciales de desarrollo pulmonar se han implicado al Fgf-10, proteínas morfogenéticas óseas, ácido retinoico y varios factores de transcripción 14. El diafragma se integra por la fusión del septum transverso, de las membranas pleuroperitoneales apareadas, del mesénquima que se presenta adyacente al esófago y del crecimiento hacia adentro de músculos de la pared corporal. Se proponía que defectos en la fusión de estos cuatro componentes, daban lugar al defecto diafragmático. Babiuk y su grupo utilizaron marcadores inmunohistoquímicos de los precursores del músculo, en conjunto con ratones mutantes para examinar la embriogénesis diafragma-frénico, y encontraron que las células y axones _iogénicos se unen dentro del pliegue pleuroperitoneal y se expanden para formar el componente neuromuscular del diafragma 15. El modelo experimental de HDC ampliamente desarrollado en ratas, resultó solamente en defectos en la formación de este sustrato de mesénquima en el pliegue pleuroperitoneal. La relación entre el diafragma en desarrollo y el pulmón ha sido tema de intenso esfuerzo del laboratorio, una de las principales preguntas es: ¿Cual aparece primero, el defecto diafragmático o la hipoplasia pulmonar? 15. En el humano, el árbol bronquial se ha desarrollado completamente a la semana 16 de gestación, pero los alvéolos continúan desarrollándose aún después del nacimiento e incrementan tanto en número como en tamaño hasta que el crecimiento de la caja torácica se completa en la edad adulta. El desarrollo de los vasos que irrigan estas estructuras acinares (vasos intra-acinares) se lleva a cabo en forma paralela y secuenciada, así como el crecimiento de los vasos preacinares sigue el desarrollo de las vías aéreas 16. La HDC se caracteriza por acompañarse de graves cambios morfológicos y estructurales pulmonares: existe marcada reducción en vías aéreas, alvéolos y vasos, tanto en humanos como en modelo experimental con HDC, se observa número reducido en las generaciones de vías aéreas, los alvéolos son pocos y tienen engrosamiento del septum o pared, existe arquitectura anormal de los acinos 6

respiratorios e incremento de tejido intersticial. Consecuentemente, disminución grave de los espacios aéreos y del área de superficie del intercambio gaseoso. Paralelo a estos cambios en vías aéreas, la vasculatura pulmonar se afecta considerablemente, muestra número reducido de arterias pulmonares por unidad de volumen pulmonar y dichas arterias pulmonares presentan engrosamiento de la adventicia e hiperplasia de la capa media, es decir remodelación vascular, que es el punto cardinal de la Hipertensión Pulmonar Persistente (Figura 3), las arterias intrapulmonares son excesivamente muscularizadas, sobre todo periféricamente y en el nivel bajo de las pequeñas arteriolas intra-acinares. Ambos pulmones están afectados, pero mayormente el ipsilateral 17-21.

Figura 3. Remodelación vascular pulmonar. Figura 3: Fotografía de microscopia electrónica que muestra gran engrosamiento del espesor de la pared arterial pulmonar, se observa un trombo dentro de la luz vascular. Tomada de: archivo fotográfico de el Dr. Guillermo Gutiérrez Calleros.

7

Existen varias teorías acerca de la patogénesis del defecto diafragmático, tales como el daño primario del pulmón ipsilateral o alteraciones en la inervación diafragmática (nervio frénico) 22 y anormalidad en el cierre del canal pleuroperitoneal 23. Se comenta además una hipótesis de “doble golpe” de acuerdo a la cual, el primer daño afecta la morfogénesis bronquial del pulmón previo al desarrollo diafragmático y un segundo daño es la compresión pulmonar debido a un desarrollo diafragmático alterado que permite la herniación de vísceras abdominales 24,25. Los eventos de crecimiento y desarrollo antenatal pulmonar, se dividen en cinco etapas (Cuadro 1), cada una de ellas, es el resultado de complejos eventos estrechamente regulados por factores genéticos, hormonales, físicos y ambientales. El líquido fetal pulmonar y los movimientos respiratorios fetales, representan los principales determinantes del desarrollo pulmonar 26.

Cuadro 1. Etapas de desarrollo pulmonar Etapa

Embriónica

Tiempo

0-7 semanas

Eventos

Formación de yemas pulmonares, traquea y bronquios.

Pseudoglandular

7 a 17 semanas

Formación de vías aéreas de conducción, red vascular y diferenciación de células.

Canalicular

17 a 27 semanas

Inicio de acinos y bronquiolos, formación de barrera alveolo/capilar.

Sacular

28 a 36 semanas

División de vías aéreas, incremento en la superficie de intercambio gaseoso.

Alveolar

36 semanas a 8 años Desarrollo alveolar marcado, con doble red capilar.

8

Diagnóstico Prenatal En los últimos años la habilidad para diagnosticar prenatalmente la HDC ha mejorado notablemente y gracias al apoyo tecnológico, actualmente es posible por medio de ultrasonografía bidimensional, tridimensional, tetradimensional

27

y/o imágenes de

resonancia magnética, documentar HDC a edades gestacionales realmente tempranas (Figura 4), con lo cual se presentan oportunidades de intervenciones terapéuticas prenatales, así como la posibilidad de derivar a la madre a un centro de tercer nivel de atención, que cuente con las diferentes modalidades terapéuticas propuestas para la atención del recién nacido con HDC, sin embargo, esto no ha representado impacto en la elevada mortalidad que se asocia a esta patología 28-31. Prenatalmente el diafragma se observa por ultrasonografía como un espacio hipoecogénico entre el tórax y el abdomen. La HDC puede ser diagnosticada al observar ultrasonográficamente el estómago, el intestino y/o el hígado dentro del tórax, asociado a desviación mediastinal hacia el lado contralateral. Cerca del 75% de los casos cursan con polihidramnios, usualmente después de las 25 semanas de gestación, a consecuencia de la compresión esofágica fetal por los órganos abdominales herniados. El principal diagnóstico diferencial de la HDC es con Enfermedad Quística Pulmonar 32.

B

A

EC

Figura 4. Diagnóstico prenatal de Hernia Diafragmática Congénita Figura 4A: Ecosonograma fetal a las 30 semanas de edad gestacional, hacia la derecha extremidad cefálica (EC), la línea punteada señala el diafragma, por encima del mismo, en 9

cavidad torácica se ubica anormalmente el estómago (E), a su lado el corazón (C) en la parte inferior y como referencia la vejiga (V); Figura 4B: imagen de resonancia magnética sagital (T2-WI) a las 25 semanas de edad gestacional, que muestra herniación del hígado a la cavidad torácica (Li). Tomadas de: 4A; archivo fotográfico personal. 4B: Cannie M. Eur Radial. 2008; 18: 13641374.

Pronóstico La HDC es una de las patologías congénitas que representa un gran reto en la Unidad de Cuidados Intensivos Neonatales (UCIN) y no obstante los avances médicos, tecnológicos y manejo agresivo multidisciplinario, la mortalidad en estos neonatos permanece elevada, pues en forma general se reporta del 50% y aquellos que sobreviven frecuentemente presentan severa morbilidad neurologica, respiratoria y/o digestiva 33. La sobrevida postnatal en HDC es baja en aquellos pacientes con otras malformaciones asociadas, es a menudo letal en el período neonatal temprano y en recién nacidos con HDC aislada (sin otras malformaciones agregadas), la sobrevida se reporta entre el 50 y 70% en centros de atención de tercer nivel especializados 34,35

.

Algunas series reportan sobrevida hasta de 80%, sin embargo, la mortalidad prenatal o neonatal temprana es excluida en esta casuística 36,37. El principal predictor prenatal pronóstico es la presencia de malformaciones agregadas que pueden ser diagnosticadas por ultrasonografía o por cariotipo fetal. En los pacientes con HDC aislada, esencialmente depende del grado de compresión pulmonar por las vísceras abdominales herniadas, los datos muestran que la mortalidad es sustancialmente elevada si el hígado está herniado en tórax 38. Muchos factores pronóstico basados en ultrasonido bidimensional convencional han sido evaluados, como la relación ventrículo izquierdo y derecho pulmonar y circunferencia torácica estómago y mediastino

39

, relación diámetro

40

, volumen de líquido amniótico y posición de

41

. Otros autores han propuesto escalas de pronóstico que

incluyen peso al nacer, calificación de Apgar e índice de McGoon, el cual evalúa la relación entre los diámetros de la arteria pulmonar y la aorta descendente, de tal 10

forma que por separado, el peso inferior a 2,755 g e índice de McGoon superior a 1.25, predice mortalidad del 80% (sensibilidad: 70 y 73% y especificidad 74 y 78%, respectivamente) 42. Se han propuesto además como factores pronóstico las mediciones de los diámetros de arterias pulmonares 43 ó ultrasonido Doppler para medir flujo de las mismas 44. La medición ultrasonográfica de la relación área pulmonar y circunferencia cefálica ha sido el método más extensamente explorado como predictor antenatal de la severidad de la hipoplasia pulmonar en los casos de HDC

45

, de tal manera que una

relación área pulmonar, circunferencia cefálica de 1.6 ó mayor, predice mortalidad del 80%, medida entre 22 y 28 semanas de edad gestacional 38,46. Recientemente como se comento previamente, se han introducido el ultrasonido tridimensional y tetradimensional, así como las imágenes por resonancia magnética, y es posible que con estas técnicas la evaluación del área pulmonar sea más exacta 47,48

.

Terapéutica fetal La

corrección

antenatal

del

defecto

favorece

el

crecimiento

pulmonar

y

consecuentemente el pronóstico; varios intentos de reparación anatómica se han realizado por medio de cirugía in utero (cirugía fetal), en las décadas de los años ochenta y noventa 49,50, pero han sido abandonados por la elevada invasión maternofetal, no es aplicable en casos con herniación intratorácica hepática (grupo de alta mortalidad postnatal) y porque en ensayos clínicos aleatorizados la sobrevida no fue mayor que en aquellos pacientes manejados convencionalmente en la etapa postnatal, con lo cual éticamente fue cuestionado severamente 51,52. Existe un abordaje de terapia fetal en HDC menos invasivo y promisorio, la oclusión temporal de la traquea fetal, la racionalización de esta terapia se deriva de los hallazgos en el Síndrome de Obstrucción Congénita de Vías Aéreas, el cual se asocia a excesivo crecimiento pulmonar. En estudios con modelo experimental se ha demostrado que la oclusión traqueal evita la salida de líquido pulmonar, lo que conduce a estiramiento pulmonar y crecimiento acelerado de vías aéreas pulmonares y vasos pulmonares

53

. La oclusión traqueal endoluminal fetal percutánea, se ha 11

considerado como una terapia fetal mínimamente invasiva, que permite la colocación de un balón entre la semana 26 y 28 de gestación a través de una incisión en el vientre materno de 3.3 mm

54

(Figura 5), sin embargo, el grupo de Seph A, informó

que este procedimiento no mejora la sobrevida ni la morbilidad 55.

Figura 5. Oclusión traqueal endoluminal fetal Figura 5: Se esquematiza el procedimiento de oclusión traqueal endoluminal fetal percutánea, guiados por ecosonografía fetal. Tomada de: Done E. Prenat Diagn. 2008; 28: 581-591.

Existen informes de resultados preliminares alentadores de oclusión traqueal endoscópica por fetoscopía percutánea, sin embargo, los criterios de selección y el tiempo de oclusión traqueal permanecen inciertos 56,57. Se han propuesto también intervenciones farmacológicas prenatales, entre las que destaca la vitamina A, de importancia fundamental para el desarrollo pulmonar. Existen informes acerca de la administración prenatal de vitamina A en modelo experimental de HDC, lo cual promueve crecimiento pulmonar y además disminuye la incidencia de esta patología

58-61

. La administración antenatal de glucocorticoides

mejora la distensibilidad pulmonar y oxigenación arterial en corderos con HDC sometidos a oclusión traqueal

62

. Otros autores han descrito que la administración 12

prenatal de dexametasona promueve cambios estructurales pulmonares positivos y mejora la sobrevida 63-64. Estudios recientes informan que la administración antenatalmente de tetrandrine mejora el crecimiento pulmonar y la remodelación vascular, cuyo mecanismo aparentemente se debe a la disminución en la expresión del factor de crecimiento epidérmico y de la endotelina-1 (ET-1) 65,56. La endotelina es uno de los más potentes vasocontrictores que actúa también como agente promitogénico y con actividad broncopulmonar. La endotelina actúa directamente sobre receptores específicos: ET-A y ET-B. Se han descrito niveles plasmáticos elevados de ET-1 en ocho recién nacidos con HDC comparados con 15 controles o recién nacidos sanos, además ellos establecieron correlación directa entre los niveles plasmáticos de ET-1, Hipertensión Pulmonar Persistente y sobrevida a las 48 h de edad postnatal y sugirieron a partir de entonces que la ET-1 es un importante mediador involucrado en la fisiopatología de la HDC 67. Se ha documentado elevada expresión de ET-1 también en modelo experimental de HDC,

68,69

. La ET-1, potencializa el efecto de mitógenos, como el factor de

crecimiento epidérmico en las células del músculo liso de las vías aéreas de los humanos y han encontrado que al administrar antagonistas selectivos de la ET-A se inhibe la proliferación de estas células 70. Con base en las propiedades biológicas específicas de la ET-1, como regulación en el tono vasomotor, proliferación de músculo liso vascular, fibrosis, hipertrofia cardiaca, vascular e inflamación, se han desarrollado recientemente fármacos antagonistas de los receptores ET-A y ET-B como el bosentán que bloquea completamente sus propiedades, por lo que serían agentes terapéuticos potenciales en pacientes con HDC 71. La forma más eficaz de bloquear el sistema ET-1 es con la administración de antagonistas de ambos receptores ET-A y ET-B, el bosentán un fármaco oralmente activo, antagonista dual o mixto de estos receptores, se ha utilizado a razón de 30 mg/Kg/día, con éxito en pacientes pediátricos con Hipertensión Arterial Pulmonar 72,73

, y se ha observado que moderan significativamente los cambios morfológicos

vasculares 74,75. 13

En 1996 Boolell y colaboradores

76,77

, describieron el uso del original y altamente

selectivo inhibidor de la fosfodiesterasa-5 (PDE-5, por sus siglas en inglés): sildenafil, para el tratamiento de disfunción eréctil en varones. Este vasodilatador ha sido utilizado recientemente como alternativa terapéutica para dilatar la vasculatura pulmonar, ya que ofrece pocos o nulos efectos adversos sistémicos 78. El citrato de sildenafil, potente, selectivo y altamente especifico inhibidor de la PDE-5, da lugar a elevación en los niveles del segundo mensajero del óxido nítrico endógeno, el monofosfato de guanosina cíclico (GMPc), que a través de la proteína cinasa G incrementa la apertura de canales de potasio, lo cual conduce a la relajación de la vasculatura pulmonar 79-82. Se ha demostrado en modelo experimental que el sildenafil incrementa la densidad capilar pulmonar, preserva el crecimiento alveolar, promueve angiogénesis pulmonar y en general facilita el desarrollo pulmonar 83. Aunque el bosentán no es un antagonista selectivo, ya que bloquea ambos receptores (ET-A y ET-B), es un agente candidato para ser administrado durante la gestación para bloquear el sistema endotelina, lo cual podría ejercer una acción benéfica en la fisiopatología de la HDC, al igual que el sildenafil, potente inhibidor de la PDE-5, con lo cual se promueve acumulación del GMPc en las células del músculo liso 84. El modelo experimental de HDC más estudiado, validado y citado, es en rata mediante la administración vía oral de nitrofén (2,4-diclorofenil-p-nitrofénil éter), que ejerce efecto teratogénico cuando se administra a ratas gestantes entre los 9 y 11 días de gestación y da lugar a HDC en descendientes. Keijzer y colaboradores han demostrado que el nitrofén produce efecto directo negativo sobre el pulmón en desarrollo, debido a que interfiere con la morfogénesis de ramificación e interrumpe la diferenciación y proliferación de células epiteliales en pulmones de las ratas expuestas 85. La embriotoxicidad del herbicida nitrofén en las ratas se ha descrito desde hace más de tres décadas. Los cambios vasculares pulmonares en este modelo son fuertemente compatibles a los encontrados en neonatos humanos con HDC, por lo cual se ha utilizado ampliamente como modelo experimental idóneo para investigar 14

los cambios morfológicos, bioquímicos y fisiopatogénicos que suceden en la HDC, así como para buscar alternativas terapéuticas para esta grave patología 86. En este modelo experimental de HDC se ha demostrado que la hipoplasia pulmonar resulta de un proceso dinámico complejo, asociado a determinantes gestacionales tempranos y tardíos, los tempranos aparentemente son secundarios a disturbios moleculares

con

base

en

factores

genéticos

y

ambientales

que

afectan

predominantemente la etapa pseudoglandular de desarrollo pulmonar (ramificación) y los determinantes tardíos se relacionan a la compresión mecánica secundaria a la herniación de vísceras abdominales a la cavidad torácica, lo cual afecta esencialmente el período canalicular, sacular y alveolar del desarrollo pulmonar 4. El mecanismo de acción fundamental del nitrofén radica en la inhibición de la deshidrogenasa-2 retinal, enzima necesaria para convertir el retinaldehído en ácido retinoico el cual participa en el desarrollo del diafragma fetal. Estos datos apoyan la hipótesis de que las alteraciones en el sistema retinoide están involucradas en la etiología de HDC 87.

15

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA La HDC resulta de falla en el cierre del canal pleuroperitoneal in utero, que sucede entre la semana 8 y 10 de la gestación. El contenido intra-abdomial herniado dentro de la cavidad torácica, conduce no solamente a desarrollo hipoplásico pulmonar ipsilateral, sino también a desarrollo y función anormal cardiaca y del pulmón contralateral. El 85% de las HDC se presentan del lado izquierdo y se caracterizan por presentar un defecto posterolateral diafragmático. La HDC ocasiona riesgos substanciales en morbilidad y mortalidad, se informa que entre 50 y 60% de los recién nacidos con HDC fallecen en el período neonatal inmediato y los sobrevivientes a menudo presentan alteraciones cardiopulmonares y neurológicas a lo largo de su vida 88, 89. Los neonatos con HDC fallecen principalmente por hipoplasia pulmonar e Hipertensión Pulmonar Persistente secundaria, sin embargo, cabe mencionar que los defectos cardiacos concomitantes contribuyen en la mortalidad de una subpoblación de recién nacidos con HDC

21

. La importancia del desarrollo vascular anormal o

remodelación vascular, como fundamental determinante en la sobrevida de los pacientes con HDC, ha sido investigada y se han encontrado anormalidades en los vasos pulmonares tanto de modelos experimentales como en recién nacidos con HDC, principalmente engrosamiento de la pared de los vasos pulmonares y muscularización de las arterias pequeñas peribronquiales, uno de los factores que influye en el desarrollo vascular es el factor de crecimiento vascular endotelial, cuya expresión se ha encontrado disminuida en pulmones hipoplásicos 19, 90. En neonatos con HDC se ha demostrado reducción considerable en el número de alvéolos y en el volumen pulmonar, lo cual se ha asociado a elevada presión parcial de bióxido de carbono en sangre arterial (PaCO2), hipoxemia, acidosis y la necesidad de soporte ventilatorio alto. La hipoplasia pulmonar se asocia no solamente con crecimiento y desarrollo estructural anormal de las vías aéreas y unidades respiratorias o alvéolos, sino también con crecimiento y desarrollo alterado de la vasculatura pulmonar. Se ha demostrado que la disminución en la distensibilidad

16

pulmonar es explicada por la hipoplasia pulmonar y no por deficiencia en la producción o liberación de surfactante 20. La mayor parte de los estudios en relación a esta patología se han enfocado a diferentes modalidades terapéuticas, tanto prenatales como postnatales, de estas últimas, la ventilación convencional gentil, la ventilación de alta frecuencia oscilatoria o tipo jet, administración intratraqueal de surfactante exógeno, óxido nítrico inhalado, oxigenador de membrana extracorpórea (ECMO, por sus siglas en inglés: Extracorporeal membrane oxigenator) por mencionar algunas, mientras que prenatalmente se han propuesto procedimientos invasivos in utero, como ligadura u oclusión traqueal para favorecer el desarrollo pulmonar, administración prenatal de corticoesteroides, de hormona liberadora de la tiroestimulante, vitamina A y fasudil, no obstante algunos centros han descrito mejoría discreta en la sobrevida con algunos de estos abordajes de manejo, la mortalidad persiste elevada, se ha reportado por algunos centros hasta del 80%, por lo cual la HDC constituye un problema serio en las UCIN, a pesar de los grandes avances médicos y tecnológicos en estas áreas 91-93. Históricamente, el manejo de esta patología ha sido difícil, complicado y en muchos de los casos infructuoso, atribuido mayormente a las modificaciones graves en la arquitectura pulmonar que suceden durante las etapas de desarrollo pulmonar prenatalmente, por lo cual recientemente se han propuesto intervenciones prenatales farmacológicas que atenúen estos cambios estructurales pulmonares y que impacten en la sobrevida. Por ello, en el presente se propone que la modulación del monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) y de la endotelina mediante sildenafil y bosentán respectivamente, podrían ser atenuados estos cambios morfológicos pulmonares, tanto en vasculatura (remodelación vascular) como en vías aéreas 71,72,75,78,83

.

Con base en lo anterior surgió la siguiente pregunta de investigación: ¿Son eficaces el sildenafil y el bosentán, administrados por separado y combinados, para el tratamiento farmacológico prenatal de la HDC en un modelo experimental?

17

JUSTIFICACIÓN Magnitud del problema La HDC es una de las patologías de mayor impacto sobre la morbilidad y mortalidad neonatal en las salas de cuidados intensivos neonatales. En la UCIN del Hospital de Pediatría del Centro Médico Nacional de Occidente, Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS), se cuenta con alrededor de 600 ingresos anuales, es un hospital de concentración y se reciben pacientes de diversas poblaciones de Jalisco, así como de cinco estados de la República Mexicana. La incidencia de la HDC, descrita en un período analizado entre marzo del 2002 a diciembre del 2003, fue de 0.9 por cada 100 ingresos

94

. En un informe reciente del

Hospital Siglo XXI del IMSS, de 65 recién nacidos con HDC, la mortalidad fue del 40% y la causa principal fue la Hipertensión Pulmonar Persistente del Recién Nacido, secundaria a la remodelación vascular 95.

Trascendencia El abordaje terapéutico de un paciente con HDC representa uno de los mayores retos para el Neonatólogo debido a la elevada mortalidad a la que se asocia, por lo cual se continúa en la búsqueda de alternativas terapéuticas. Actualmente es posible diagnosticar HDC mediante utrasonografía en el primer trimestre del embarazo, con lo cual se ha abierto la posibilidad para diferentes intervenciones prenatales, como la reparación quirúrgica del defecto diafragmático fetal in utero, procedimiento que se ha abandonado por la elevada incidencia de trabajo de parto pretérmino y morbi-mortalidad. Se ha intentado también oclusión traqueal por medio de intervención laparoscópica, para promover crecimiento pulmonar prenatal, sin embargo, los resultados hasta el momento no han demostrado impacto en la sobrevida 96.

Vulnerabilidad Dada la elevada morbilidad y mortalidad que acompaña a la HDC, la poca accesibilidad a algunas opciones de manejo tanto prenatales como postnatales en 18

países económicamente emergentes como el nuestro y el no contar con otras terapias alternativas como ECMO, ventilación de alta frecuencia oscilatoria y óxido nítrico, es importante investigar sobre intervenciones farmacológicas prenatales.

Factibilidad En el Centro de Investigación Biomédica de Occidente del Instituto Mexicano del Seguro Socia (IMSS), se registro y aprobó para su ejecución el presente trabajo de investigación y se le otorgo el número de dictamen: 1305-2006-02 (anexo 1) en dicho sitio se desarrolló el experimento, se estandarizó e implementó el modelo experimental El presente trabajo de investigación contó con financiamiento intrainstitucional por concurso de parte del Fondo de Fomento a la Investigación, IMSS, con Número de registro FOFOI: 2006/1A/I/031, (anexo 2) y extrainstitucional, como respuesta a la convocatoria para someter a concurso los resultados preliminares en el Miami Children’s Hospital de Miami Florida, USA, en colaboración con Sheridan Health Corporation y fue otorgado en 2007 y 2008 (anexos 3 y 4), lo cual permitió la compra del herbicida nitrofén y de tabletas de bosentán entre otros insumos. El sildenafil en tabletas de 50 mg se encuentra en el cuadro básico del IMSS, con clave 4308.

19

OBJETIVOS Objetivo general Determinar si la administración prenatal de sildenafil y/o bosentán atenúa la remodelación vascular, promueve ramificación bronquial y favorece la alveolarización en un modelo experimental de HDC.

Objetivos particulares a) Desarrollar el modelo experimental de HDC. b) Demostrar macroscópica y microscópicamente la hipoplasia pulmonar. c) Conocer la relación peso bloque cardiopulmonar/peso corporal. d) Comparar el espesor de los vasos arteriales pulmonares y consecuentemente la luz o diámetro interno de los mismos entre los diferentes grupos de estudio. e) Determinar fibrosis intersticial pulmonar. f) Evaluar ramificación de vías aéreas entre los grupos de estudio. g) Estimar alveolarización y características morfométricas alveolares en los grupos de estudio.

20

HIPÓTESIS La administración prenatal de sildenafil y/o bosentán atenúa los cambios morfológicos o estructurales pulmonares, la remodelación vascular, promueve la ramificación bronquial y favorece la alveolarización en un modelo experimental de HDC.

21

MATERIAL Y MÉTODOS

El presente trabajo de investigación fue registrado y aprobado para su ejecución por el Comité Local de Investigación del Centro de Investigación Biomédica de Occidente, IMSS, y se le otorgó el número de dictamen 1305-2006-02 (anexo 1).

Diseño del estudio Se trata de un estudio experimental, aleatorizado y cegado.

Modelo experimental Se utilizaron ratas hembras Wistar adultas, las cuales fueron apareadas con machos de la misma cepa y por medio de lavado y frotis vaginal, se consideró día postconcepcional 0 (DPC 0) cuando se encontraron espermatozoides en dicho frotis 10

. En el DPC 9, mediante cánula orogástrica se administró 100 mg de nitrofén (2,4-

diclorofenil-p-nitrofenil éter, CAS No. 1836-75-5; Supelco®) previamente disuelto o reconstituido en 1 cc de aceite de olivo

10

y mezclado con un sonicador Virtis,

VirSonic 100®, excepto al grupo control o testigo negativo (grupo1).

Intervención farmacológica prenatal Se integraron al azar 5 grupos con ratas gestantes: 

Grupo 1 (testigo negativo).- se administró 1 mL de aceite de olivo vía oral (VO) el DPC 9 y 1 mL de solución glucosada al 5% durante los DPC 16 al 20.



Grupo 2 (testigo positivo).- cada rata gestante recibió 100 mg de nitrofén 24 VO el DPC 9, reconstituido en 1 mL de aceite de olivo y 1 mL de solución glucosada al 5% VO los DPC 16 al 20.



Grupo 3.- se administraron 100 mg de nitrofén a cada rata gestante VO el DPC 9, reconstituido en 1 mL de aceite de olivo, así como 100 mg de sildenafil

79-82

por

Kg de peso y por dosis, diluido en 1 mL de solución glucosada al 5% VO durante los DPC 16 al 20.

22



Grupo 4.- recibieron 100 mg de nitrofén VO el DPC 9, reconstituido en 1 mL de aceite de olivo, así como 30 mg de bosentán

84

por Kg de peso y por dosis VO,

diluido en 1 mL de solución glucosada al 5%, en los DPC16 al 20. 

Grupo 5.- se administraron 100 mg de nitrofén a cada rata gestante VO el DPC 9, reconstituido en 1 mL de aceite de olivo, así como 100 mg de sildenafil por Kg y por dosis y 30 mg de bosentán por Kg y por dosis, diluido cada uno en 0.5 mL de solución glucosada al 5%, administrado VO en dosis separadas, durante los DPC16 al 20.

Cesárea y preparación de tejido pulmonar En el día 21 de gestación, previa administración de 50 mg de pentobarbital por Kg y por dosis, intra-peritonealmente, se realizó cesárea

87

para obtener los productos vía

abdominal, los cuales fueron sacrificados y pesados con una balanza digital portátil (CS-200 Ohaus®). Mediante laparotomía bajo microscopio binocular quirúrgico (Carl Zeiss® OPMI 1, microscopio para microcirugía, Germany) se evaluó el defecto diafragmático y/o desarrollo de HDC y a través de esternotomía, se disecó el bloque cardiopulmonar, el cual fue pesado con una balanza analítica digital (Explorer Ohaus®), se tomaron dimensiones de largo y ancho en ambos pulmones. Se colocó el

bloque cardiopulmonar

en formol

amortiguado (bufferizado)

al

10%

y

posteriormente fue embebido en bloque de parafina 87 (Figura 6).

A

B

E

C

F

D

G

Figura 6. Fotografías representativas de la metodología. 23

Figura 6A: Cesárea, 6B: Peso de las crías obtenidas por cesárea, 6C: Disección bajo microscopio binocular quirúrgico, 6D: Laparotomía y esternotomía, 6E: Peso del bloque cardiopulmonar, 6F: Bloque cardiopulmonar de características normales y 6G: Laminillas y bloque de parafina.

Se realizaron cortes con micrótomo (Leica®, serie 050131379, cat. 14050237993) del parénquima pulmonar de 4µ, se montaron en portaobjetos que fueron codificados con lápiz de punta de diamante y posteriormente teñidos con hematoxilina y eosina, PAS (ácido periódico de Shift) y con tricrómico de Masson, en total tres laminillas por cada bloque cardiopulmonar, para observación análisis y lectura al microscopio (Olympus® BX51) equipado con micrómetro óptico y analizador de imágenes (Imagepro® Plus, MediaCybernetics), por parte de el Médico Patólogo.

Evaluación patológica Las mediciones fueron realizadas por un observador experto (Médico Patólogo), quien ignoraba a cual grupo pertenecían las laminillas. Se utilizó un microscopio Olympus® BX51 equipado con analizador de imágenes (Image-pro® plus, MediaCybernetics) y se midieron:

 Espesor en micras de la pared arterial.  Diámetro en micras de la luz arterial.  Relación pared/luz arterial pulmonar.  Fibrosis del tejido intersticial pulmonar.  Promedio de bronquiolos terminales.  Conteo alveolar radial *.  Cálculo del intersepto linear promedio **. Tanto el espesor de la pared arterial como el diámetro de la luz de la misma fueron medidos y expresados en µ, en 10 campos y se promediaron, posteriormente se obtuvo la relación pared/luz arterial pulmonar. Se eligieron vasos arteriales periféricos cercanos a los bronquiolos para realizar estas mediciones ya que los primeros cambios en espesor de la pared arterial se presentan en la periferia 17-21. 24

En relación a la evaluación de la fibrosis del tejido intersticial pulmonar, obedeció a la imagen subjetiva que el Médico Patólogo percibió, mediante la tinción de tricrómico de Masson que se acercaba a la siguiente descripción: a. Fibrosis leve: Aquella que no supera en 25% del total de 10 campos evaluados y dispersa en el intersticio sin formar cúmulos o agregados. b. Fibrosis moderada: Aquella que no supera en 50% del total de 10 campos evaluados y dispersa en el intersticio sin formar cúmulos o agregados. c. Fibrosis severa: Aquella que supera en 50% del total de 10 campos evaluados dispersa en el intersticio o formando cúmulos o agregados concéntricos alrededor de los vasos y bronquios. Los bronquiolos terminales fueron contados en 10 campos de la periferia y posteriormente se promediaron. La alveolarización fue evaluada mediante el conteo alveolar radial (RAC, por sus siglas en inglés: Radial alveolar count) y las características morfológicas de los alvéolos, por medio del intercepto linear medio (MLI, por sus siglas en inglés: Mean linear intercept); ante la disminución del número de alvéolos se ha demostrado reducción del RAC e incremento del MLI 97. * Conteo alveolar radial. Es un método estandarizado y utilizado ampliamente para estimar la cantidad de alvéolos, fue introducido en 1960 por Emery y Mithal, para esta medición se precisa ubicar un bronquiolo terminal o respiratorio que se identifica por estar cubierto de epitelio en forma parcial, a partir del centro del mismo, se traza una línea perpendicular hasta la pleura o al tejido conectivo ínterlobular y se cuenta el número de alvéolos que cruzan o atraviesan dicha línea perpendicular, este parámetro se examina en 10 campos de cada caso a 40X de aumento y se obtiene el promedio 98-100. **Cálculo del intersepto linear promedio. Método para evaluar características morfométricas de los espacios aéreos que estima indirectamente el tamaño de los alvéolos, mediante la distancia entre las paredes alveolares o septos alveolares. Se trazan 6 líneas, se cuenta el número de interseptos que las cruzan y se aplica la siguiente fórmula: 97 MLI= 2 * ltot/Ix. 25

Donde: ltot: La suma de la distancia de todas las líneas trazadas en el área, Ix es el número total de intersecciones (paredes alveolares) que cruzan la línea trazada 101,102. Acerca de la dosis de sildenafil utilizada en el presente estudio (100 mg/Kg), fue elegida con base en informes bibliográficos previos, los cuales mencionan que la dosis/respuesta efectiva de sildenafil en el modelo experimental utilizado es 100 mg por Kg, aunque considerablemente mayor a la dosis apropiada en humanos, se ha demostrado que en estudios in vivo en ratas produce concentraciones plasmáticas comparables a los niveles séricos obtenidos en humanos cuando reciben 1 mg por Kg

103

, lo cual aunado a los estudios de farmacocinética y farmacodinamia del

fármaco, refleja que el metabolismo de sildenafil en ratas es 100 veces mayor que en el humano 104. Algunos informes han descrito alto rango del metabolismo hepático del sildenafil en rata, con lo cual la administración de 100 mg por Kg ha permitido que se alcancen niveles plasmáticos apropiados para obtener el efecto deseado 83,105,106.

Cálculo de muestra Una vez que se obtuvieron resultados preliminares, se utilizó una fórmula para calcular el tamaño de muestra cuando se espera encontrar diferencia de promedios y se conoce la desviación estándar, dada una confiabilidad y un poder. La variable utilizada para este cálculo fue el espesor de la pared arterial, a partir de una muestra piloto previa.

n=

S12+ S22

(z1-α/2+z1-β) 2

(X1 - X2)2 Donde: S1= Desviación estándar de la población control. S2= Desviación estándar de la población experimental. X1= Promedio de la población control. X2= Promedio de la población experimental. 26

(X1–X2)= Diferencia de medias esperadas que desea ser contrastada. α= Nivel de significancia o probabilidad de error tipo 1. 1-α/2= Percentil bilateral para el nivel de significancia asignado. Z0.975= Z de la distribución normal estandarizada que deja un área de 0.9750 a la izquierda, lo que implica confiabilidad de 95.0%. β= Probabilidad de error tipo 2. 1-β= Percentil unilateral para la beta (β) asignada. Z0.80= Z de la distribución normal estandarizada que deja un área de 0.8000 a la izquierda, que implica un poder de 80.0%.

Despejando: α= 0.05 z1

- α/2

β= 0.8



z1

n= 1.252 + 0.702

= Z0.975 = 1.96 = Z0.8 = 0.842

(1.96 + 0.84)2

(4.25 – 3.0)2

n= 10.31028

n= 12 crías por grupo

n= 12 Tamaño de muestra mínimo necesario que asegura, con probabilidad de 0.95 (confiabilidad del 95%), que si la diferencia que se desea contrastar es verdadera, el estudio lo confirme y que si esta diferencia no es cierta, el estudio confirme que la diferencia no es de la magnitud que se plantea, con probabilidad de 0.80 (poder de 80%).

Departamento dónde se desarrolló el proyecto Laboratorio de Mutagénesis, Centro de Investigación Biomédica de Occidente, Instituto Mexicano del Seguro Social, Guadalajara, Jalisco. 27

Consideraciones éticas El experimento fue realizado de acuerdo a las Normas Institucionales y Gubernamentales para el uso y manejo ético de los animales de experimentación (NOM-062-ZOO-2001). Asimismo, una vez concluida la fase experimental, los animales utilizados fueron entregados a los responsables del bioterio, quienes decidieron el destino final de los animales.

Análisis estadístico Los datos cuantitativos se presentan como promedio±desviación estándar. Mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov se evaluó la distribución de los datos; la cual resultó significativa en la gran mayoría de las variables, esto significa que los datos no presentaron distribución normal, por lo cual fueron analizados con estadística inferencial no paramétrica y la n o tamaño de muestra calculada para cada grupo (n=12) fortalece esta decisión. Las comparaciones se hicieron mediante la prueba de Mann-Whitney para muestras independientes, entre el grupo placebo o control negativo versus el grupo control positivo o nitrofén, para demostrar el modelo experimental de HDC. Así mismo se compararon el grupo control positivo o nitrofén versus los grupos 3 (sildenafil), 4 (Bosentán) y 5 (sildenafil y bosentán). Para las variables cualitativas se realizó la prueba exacta de Fisher entre el control negativo o placebo y control positivo o nitrofén, de igual forma el control positivo se comparó con los grupos tratados 3, 4 y 5 y en los casos en que la variable estudiada tuvo más de dos categorías o niveles se realizó χ2. Para analizar la probabilidad de interacción entre los diferentes tratamientos se realizó un modelo de regresión. Se considero un valor estadísticamente significativo cuando p fue < 0.05 y un nivel de confianza de 95%. Se utilizó el paquete estadístico SPSS (Statistical package for the social sciences, por sus siglas en inglés) versión 15.

28

OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES

Variable

Tipo de

Unidad de

variable

medida

Continua

Gramos

Peso corporal

Peso bloque

Continua

Miligramos

Discreta

Frecuencia

Escala

Estadístico

Cuantitativa

Medidas de tendencia

continua

central

Cuantitativa

Estadística de

continua

diferenciación

Cuantitativa

Estadística de

Continua

diferenciación

Cuantitativa

Estadística de

continua

diferenciación

Cuantitativa

Estadística de

continua

diferenciación

Cuantitativa

Estadística de

continua

diferenciación

Cuantitativa

Estadística de

continua

diferenciación

Cuantitativa

Estadistica de

continua

diferenciación

Cualitativa

Estadística de

cardiopulmonar Relación peso bloque cardiopulmonar/peso corporal Dimensiones pulmón

Continua

Milimetros

derecho Dimensiones pulmón

Continua

Milimetros

izquierdo Espesor de pared arterial

Diámetro de la luz arterial

Relación pared/luz arterial

Fibrosis intersticial

Continua

Continua

Continua

Nominal

Micras

Micras

Frecuencia

Escala

pulmonar Promedio de bronquiolos

Conteo alveolar radial

diferenciación Continua

Continua

Frecuencia

Frecuencia

(RAC) Intersepto linear medio (LMI)

Continua

Frecuencia

Cuantitativa

Estadística de

continua

diferenciación

Cuantitativa

Estadística de

continua

diferenciación

Cuantitativa

Estadística de

continua

diferenciación 29

RESULTADOS El modelo experimental de HDC se ha reproducido fielmente en el presente estudio; las crías que desarrollaron HDC se caracterizaron por presentar hipoplasia pulmonar izquierda significativa (Figura 7), evaluado mediante la disminución en la relación peso bloque cardiopulmonar/peso corporal en las crías expuestas a nitrofén: 0.0261±0.0028 en contraste con el grupo control negativo o placebo: 0.0393±0.0054 (p=0.0001)

y

confirmado

por

las

dimensiones

del

pulmón

izquierdo,

significativamente menores (p=0.0001) en las crías expuestas a nitrofén: 4.5±0.91 mm de largo y 2.5±0.49 mm de ancho, contra 8.1±0.93 mm de largo y 3.2±0.45 mm de ancho (p=0.003) en las crías que recibieron placebo (Cuadro 2).

A

B

Figura 7. Fotografías representativas de hipoplasia pulmonar. Figura 7A: Bloque cardiopulmonar con dimensiones dentro de límites normales. 7B: bloque cardiopulmonar con hipoplasia del pulmón izquierdo.

30

Cuadro 2. Relación peso bloque cardiopulmonar/peso corporal y dimensiones pulmonares del grupo control negativo o placebo (n=12) y grupo control positivo o nitrofén (n=12)

Grupo

1: Control Negativo

Relación peso

Dimensiones

Dimensiones

BCP/ peso corporal

pulmón izq.

pulmón izq.

largo (mm)

ancho (mm)

0.0389±0.0054

8.1±0.93

3.2±0.45

0.0261±0.0028

4.5±0.91

2.5±0.49

0.0001

0.0001

0.003

(placebo) 2: Control positivo (nitrofén) Valor de p

BCP: Bloque cardiopulmonar; izq: izquierdo.

31

El modelo de HDC ha sido reproducible y semeja en gran medida el punto cardinal de la HDC, la remodelación vascular, tal como se demuestra en la Figura 8, ya que se encontró mayor espesor de la pared arterial medida en micras en el grupo positivo o nitrofén (4.5±0.67µ), lo cual traduce incremento en la muscularización vascular, en comparación con el grupo control negativo o placebo (3.0±1.2µ), diferencia que resultó ser significativa (p=0.004).

A

6

5

4.5±0.67µ

B

3.0±1.2µ

µ

4

3

2

1

p=0.004 0

Placebo

Nitrofén

Figura 8. A: Gráfica que muestra promedio y desviación estándar del espesor de la pared arterial (µ) de ambos grupos, control negativo o placebo (n=12) y control positivo o nitrofén (n=12). B: microfotografía representativa del aumento de espesor de la pared arterial, se observa además disminución alveolar (Tinción hematoxilina y eosina, 40X).

32

La alveolarización disminuyó significativamente (p=0.001) en las crías que desarrollaron HDC en contraste con las crías sin HDC del grupo control negativo o placebo, como se muestra en la Figura 9, el conteo alveolar radial (RAC) en el grupo control negativo fue en promedio 5.46 ± 1.6 y en el grupo control positivo el cual recibió nitrofén descendió a 3.1 ± 1.0.

A

B 8

5.4±1.6

Frecuencia

7 6 5

3.1±.1.0

4 3 2 1

p=0.001

0

Placebo

Nitrofén

Figura 9. A: Se muestra promedio y desviación estándar del número de alvéolos obtenidos mediante el método de conteo alveolar radial (RAC), del grupo control negativo o placebo (n=12) versus control positivo (n=12). B: Microfotografía representativa del grupo control positivo o sildenafil que muestra disminución de los espacios aéreos (Hematoxilina y eosina, 10X).

33

Otro de los hallazgos morfológicos característicos de la patología (HDC), además de la disminución en la alveolarización, es el compromiso en la ramificación bronquiolar, en el presente, se encontró franca disminución en bronquiolos terminales en las crías con HDC del grupo control positivo o nitrofén, como se muestra en la figura 10.

20

A

B

Frecuencia

11.2±1.9 8.2±1.7 10

p=0.001 0

Placebo

Nitrofén

Figura 10. A: La gráfica muestra promedios y desviación estándar de los bronquiolos terminales en grupo control negativo o placebo y del grupo control positivo o nitrofén. B: Imagen representativa del grupo control positivo, en la cual se observan bronquiolos ectásicos y escasos (Hematoxilina y eosina, 40X).

34

En relación a los grupos de estudio que recibieron las intervenciones farmacológicas, sildenafil y bosentán, se encontró lo siguiente: En las crías con HDC cuyas madres recibieron sildenafil (grupo 3) hubo disminución significativa (p=0.001) en el espesor de la pared arterial medida en micras, las crías con HDC sin intervención farmacológica presentaron 4.5±0.67µ de espesor mientras que las recibieron sildenafil presentaron 3.2±0.75µ, tal como se muestra en la Figura 11.

A

B 6

4.5±0.67µ

5

3.2±0.75µ

µ

4

3

2

1

p=0.001 0

N

N+S



Figura 11. A: Se muestran diferencias significativas en el grosor de la pared arterial, mayor en el grupo control positivo (n=12) o nitrofén (N) sin intervención farmacológica, en contraste con el grupo 3 (n=12) que recibió además del nitrofén sildenafil (N+S) prenatalmente (grupo 3). B: Microfotografía representativa del grupo 3, cuya intervención farmacológica fue el sildenafil, que ejemplifica la disminución en el espesor de la pared arterial (flecha ; hematoxilina y eosina, 40X).

En consecuencia a la disminución en el espesor de la pared arterial del grupo que recibió sildenafil se mejoró significativamente (p=0.03) la relación pared/luz arterial, como se puede observar en el Cuadro 3, donde se muestra mejor relación pared/luz arterial en el grupo que recibió sildenafil (grupo 3). 35

Cuadro 3. Relación pared/luz arterial del grupo 2 ó nitrofén sin intervención farmacológica (n=12) versus grupo 3 ó nitrofen + sildenafil (n=12)

Relación pared/luz

Grupo 2: Nitrofen

Grupo 3: Nitrofén + sildenafil

arterial

n (%)

n (%)

1:1

5 (41.7)

1 (8.3)

1:2

6 (50)

8 (66.7)

1:3

1 (8.3)

3 (25)

p=0.03

36

Respecto al grupo 4 que recibió bosentán como intervención farmacológica, se encontró incremento estadísticamente significativo (p=0.002) en los bronquiolos terminales, como se muestra en la figura 12, ya que el grupo control positivo o nitrofén presentó 8.2 ± 1.7, mientras que el grupo 4 ó nitrofén + bosentán presentó 12.9 ± 3.4.

A

B

20

Frecuencia

12.9±3.4

8.2±1.7 10

p=0.002 0

N

N+B

Figura 12. A: Se gráfica la cantidad de bronquiolos terminales en promedio con sus respectivas desviaciones estándar, en el grupo control positivo n=12 (nitrofén sin intervención farmacológica; N) contra el grupo 4 ó nitrofén + bosentán n=12 (N+B). B: Microfotografía representativa en la cual se observa incremento de bronquiolos terminales. (Hematoxilina y eosina, 10X).

En este mismo grupo 4, se encontró disminución significativa (p=0.02) en la fibrosis intersticial, en aquellas crías con HDC que recibieron bosentán (grupo 4) en contraste con las crías con HDC y sin intervención farmacológica del grupo 2 (nitrofén), como se observa en el cuadro 4.

37

Cuadro 4. Fibrosis intersticial en el grupo 2 ó nitrofén (n=12) versus grupo 4 ó nitrofén + bosentán Fibrosis intersticial

Grupo 2: Nitrofen

Grupo 4: Nitrofén + bosentán

n (%)

n (%)

Leve

5 (41.7)

11 (91.7)

Moderada

7 (58.3)

1 (8.3)

p=0.02

El grupo 5 que recibió ambas intervenciones farmacológicas, también mostró incremento significativo (p=0.0001) en bronquiolos terminales, respecto al control positivo ó nitrofén; que presentó 8.2±1.7, mientras que el grupo 5 (nitrofén + sildenafil + bosentán; presentó 13.5±2.2. (Figura 13).

A

B

20

Frecuencia

13.5±2.2

8.2±1.7 10

P=0.0001 0

N

N+S+B

Figura 13. A: Se grafican promedio y desviación estándar de bronquiolos terminales en las crías del grupo 2 (n=12) que fueron expuestas a nitrofén (N) únicamente, comparativamente con el grupo 5 (n=12) que recibió las dos intervenciones farmacológicas propuestas, sildenafil + bosentán (N+S+B). B: Microfotografía que representa los cambios positivos en el promedio de bronquiolos terciarios (Hematoxilina y eosina, 40X). 38

Así mismo en relación al espesor de la pared arterial, se encontró disminución estadísticamente significativa (p=0.005) en el grupo 5 que recibió ambas intervenciones farmacológicas, nitrofén + sildenafil + bosentán, (N+S+B), el cual presentó 3.4 ± 1.6 µ mientras que el grupo control positivo ó nitrofen (N), 4.5 ± .67 µ, como se muestra en la figura 14.

B

A 6

4.5±.67µ 3.4±1.6µ

5

µ

4

3



2

1

P=0.005 0

N

N+S+B

Figura 14. A: Se muestran promedios y desviaciones estándar del grupo 2 (n=12) ó control positivo (nitrofen), contrastado con el grupo 5 (n=12) que recibió ambas intervenciones (nitrofén + sildenafil + bosentán N+S+B). B: Se observa disminución en el espesor de la pared arterial (flecha ) en esta microfotografía representativa del grupo 5 (Hematoxilina y eosina, 40X).

En consecuencia a esta disminución del espesor de la pared arterial, mejoró la relación pared/luz arterial en el grupo 5 que recibió las dos intervenciones farmacológicas, en contraste con el grupo testigo positivo, diferencia que fue estadísticamente significativa (p=0.007; cuadro 5).

39

Cuadro 5. Relación pared/luz arterial del grupo 2 ó nitrofén sin intervención farmacológica (n=12) versus grupo 5 ó nitrofen + sildenafil + bosentán (n=12) Relación pared/luz

Grupo 2: Nitrofen

Grupo 5: Nitrofén +

arterial

n (%)

sildenafil + bosentán n (%)

1:1

5 (41.7)

0 (0)

1:2

6 (50)

10 (83.3)

1:3

1 (8.3)

1 (4.2)

p=0.007

Finalmente en relación a la alveolarización, la cual fue evaluada mediante el método de RAC y las características morfométricas alveolares, evaluadas por medio del intersepto linear medio (MLI, por sus siglas en inglés), no se encontraron diferencias significativas entre los grupos que recibieron nitrofén solamente (grupo 2 o control positivo) versus nitrofén + intervenciones farmacológicas (grupos 3, 4 y 5), representado en forma gráfica en las Figuras 15 y 16.

40

5

3.1±1.0

Frecuencia

4

3

2.0±.37

2.1±.54

2.0±.39

2

1

0

N

N

N+B

N+S

N+B

N+S+B

N+S

N+S+B

Figura 15. Se presenta en forma gráfica el número de alvéolos (RAC) en cantidades muy similares entre los grupos de estudio. N: Nitrofen; N+S: Nitrofén + Sildenafil; N+B: Nitrofén +

41

Bosentán y N+S+B: Nitrofén + Sildenafil + Bosentán. En la parte inferior se muestran microfotografías representativas de cada uno de los grupos de estudio (n=12 en cada grupo).

80

70

49.3±13.7 49.2±8.4

57±11.3 57.5±11.3

Frecuencia

60

50

40

30

20

10

0

N

N+S

N+B

N+B+S

N

N+S

N+B

N+S+B

Figura 16. En los grupos de estudio se muestra el comportamiento similar del intersepto linear medio (MLI) entre grupos. N Nitrofen; N+S Nitrofén + Sildenafil; N+B Nitrofén + 42

Bosentán; N+S+B Nitrofén + Sildenafil + Bosentán y en la parte inferior de la gráfica. se muestran microfotografías representativas de cada grupo de estudio (n=12 en cada grupo).

En un modelo de regresión se descartó interacción entre grupos en relación a espesor arterial y bronquiolos terminales. Se evaluó el espesor de la pared arterial pulmonar en micras, en función de los tratamientos sildenafil y bosentán (grupos 3 y 4) y sildenafil + bosentán (grupo 5), el único factor que resultó ser significativo fue el sildenafil con coeficiente de regresión de -0.79 y significancia de 0.015, lo cual implica que las crías con HDC que recibieron sildenafil disminuyeron el espesor de la pared arterial en la magnitud de dicho coeficiente de regresión; así mismo, en relación al incremento de bronquiolos terminales, solamente el bosentán resultó significativo con coeficiente de regresión de 4.646 con p=0.001, es decir que el grupo que recibió bosentán presentó incremento de bronquiolos terminales en la magnitud del coeficiente de regresión mencionado, no así el grupo que recibió sildenafil.

43

DISCUSIÓN El desarrollo de un modelo animal apropiado de HDC, el cual permitió simular estrechamente los cambios morfológicos macroscópicos y microscópicos de esta patología en el recién nacido, fue esencial en el presente trabajo. En las crías cuyas madres recibieron nitrofén en el DPC 9, se documentó HDC durante la disección bajo microscopio binocular para microcirugía; primeramente se identificó el defecto diafragmático por el cual migran las vísceras abdominales a la cavidad torácica, posteriormente se encontró estomago, asas intestinales y/o hígado, tal como sucede en el neonato

24,25

, consecuentemente se ha demostrado la

hipoplasia pulmonar izquierda, que ha sido muy evidente a simple vista en muchos de los casos y se ha confirmado en forma objetiva por la medición de ambos pulmones, ya que se encontraron dimensiones menores en el pulmón izquierdo de las crías que desarrollaron HDC, comparativamente con aquellas que no la desarrollaron, diferencia que fue estadísticamente significativa (p=0.0001) y no se observó en el pulmón derecho (Cuadro 2). Así mismo, las crías con HDC se caracterizaron por presentar significativamente (p=0.0001) menor relación peso bloque cardiopulmonar/peso corporal en relación a las crías del grupo 1 (control negativo ó placebo) que no desarrollaron HDC, hecho que concuerda con estudios previos en los cuales utilizaron modelo experimental de HDC 105,106 (Cuadro 2). Los hallazgos morfológicos en las crías de las ratas gestantes que recibieron nitrofén fueron consistentes con reportes previos de la literatura

107

. El análisis

histopatológico de las laminillas reveló engrosamiento de la pared de los vasos arteriales pulmonares de las crías con HDC que fueron expuestas a nitrofén en contraste con aquellos del grupo control o placebo (Figura 8), dicho incremento del grosor de los vasos arteriales pulmonares se ha considerado un marcador subrogado de remodelación vascular en HDC y en Hipertensión Pulmonar Persistente del Recién Nacido (HPPRN) 105. Además del engrosamiento de la pared arterial, en el modelo de HDC se encontró reducción significativa tanto en los espacios aéreos como en la ramificación bronquial 44

(Figuras 9 y 10), condición sine qua non de la hipoplasia pulmonar, en conjunto estos cambios morfológicos y estructurales histopatológicos pulmonares que se han documentado en el presente trabajo, representan la característica principal de la HDC y explican en gran parte su fisiopatología

108

; así mismo, confirman la fiel

reproducción del modelo. En los grupos de estudio tratados (grupos 3, 4 y 5), que recibieron las intervenciones farmacológicas propuestas, sildenafil y/o bosentán, se consiguió atenuar los cambios morfológicos y estructurales pulmonares, especialmente el desarrollo anormal de la pared vascular pulmonar, que ocasiona HPPRN en los pacientes con HDC y que dicho sea de paso, representa la principal causa de muerte en estos pacientes

109,110

.

Y así, en el grupo 3 que recibió sildenafil se encontró disminución significativa (p=0.001) en el espesor de la pared arterial medida en micras (Figura 11), con lo cual se moderó la disminución en la luz de los vasos, expresado como relación pared/luz arterial (Cuadro 3), hallazgo importante reportado previamente en modelo experimental de HDC por Roubliova y su grupo 111. En otras palabras, el sildenafil administrado prenatalmente atenúo la remodelación vascular, con lo cual esperaríamos menor reactividad en el tono vascular pulmonar postnatalmente y probablemente, mejor respuesta a las estrategias terapéuticas propuestas, como el óxido nítrico inhalado

112–114

, ya que en los neonatos con

HPPRN, secundaria a HDC, son considerados “no respondedores” a este vasodilatador selectivo de la vasculatura pulmonar 115,116. En estudios recientes realizados en corderos recién nacidos que viven en grandes alturas sobre el nivel del mar (3600 m) y que desarrollan Hipertensión Pulmonar, atribuida a elevada expresión y actividad de la fosfodiesterasa 5, motivo por el cual fueron tratados con sildenafil intravenoso en infusión a razón de 16.6 µg/Kg/min, se encontró mayor capacidad contráctil de los vasos pulmonares con elevación de la dilatación máxima de los mismos 117. Dentro del desarrollo, el patrón de ramificación permanece como una de las principales características de crecimiento y desarrollo orgánico, la ramificación pulmonar permite que se lleve a cabo eficientemente el mecanismo de intercambio de gases del ambiente al organismo y viceversa, este proceso de desarrollo 45

primariamente

ocurre

in

utero

y

se

ha

demostrado

que

se

restringe

considerablemente en neonatos portadores de HDC. En humanos, la ramificación bronquiolar pulmonar se completa alrededor de la semana 27 de gestación durante la etapa canalicular y en ratas se completa alrededor del día 18 postconcepcional

110

;

en los grupos 4 y 5 que recibieron en los DPC 16 al 20 el bosentán (bloqueador de la endotelina) se favoreció significativamente el desarrollo de bronquiolos terminales ó terciarios, como se observa en la Figura 12, los cuales están recubiertos de un epitelio capaz de llevar a cabo correctamente el intercambio gaseoso. Dentro de la mejoría observada en la arquitectura pulmonar, en el grupo 4 que recibió bosentán se encontró disminución significativa (p=0.02) en la fibrosis intersticial pulmonar, en contraste con el grupo 2 ó control positivo sin intervención farmacológica (Cuadro 4), sin embargo, es menester mencionar que en el presente trabajo para la evaluación de la fibrosis intersticial pulmonar se utilizó un método subjetivo o cualitativo, resultaría deseable evaluar en forma más precisa dicha fibrosis pulmonar mediante otras alternativas de manera cuantitativa, como la inmunohistoquímica 118, 119. En el grupo 5 que recibió ambas intervenciones farmacológicas propuestas (sildenafil y bosentán) también se observo incremento en bronquiolos terminales o terciarios como en el grupo 4 que solamente recibió bosentán (Figuras 12 y 13). Este incremento de bronquiolos terminales o respiratorios repercutiría directamente en la función vital (intercambio de gases), gravemente comprometida en pacientes con HDC. Otro hallazgo significativo en el grupo 5, el cual recibió las dos intervenciones farmacológicas, fue la disminución en el espesor de la musculatura vascular (Figura 14) en consecuencia mejoró la relación pared/luz arterial (Cuadro 5). En el humano, el desarrollo de los alvéolos comienza alrededor de la semana 36 de gestación, continúa en la vida postnatal e inicia con la aparición de septums alveolares, los cuales se dividen en sacos aéreos primitivos en la etapa sacular del desarrollo pulmonar, posteriormente se forman pequeñas unidades esféricas que darán lugar a los alvéolos propiamente dichos, en la etapa alveolar de desarrollo pulmonar, a partir de la cual y hasta los primeros años de la vida, se multiplica 46

considerablemente esta área de intercambio gaseoso y disminuye el diámetro de estos espacios aéreos. La remodelación final de las estructuras alveolares se alcanza hasta la edad adulta

120

. Este fundamental evento de desarrollo pulmonar

necesario para llevar a cabo el intercambio gaseoso, se interrumpe en presencia de HDC. En la rata, modelo experimental empleado en el presente trabajo, el desarrollo alveolar inicia al término de la gestación, con incremento en la multiplicación de los sacos alveolares en el día 3 y 8 postnatal; la expansión de la población alveolar continúa agudamente hasta el primer mes de edad, pero persiste hasta la edad adulta

102

, situación que explicaría en parte el motivo por el cual no se encontraron

cambios en sentido positivo en la alveolarización con las intervenciones farmacológicas propuestas (Figuras 15 y 16), ya que como se comentó en la metodología, se interrumpió la gestación vía cesárea al día 21 postconcepcional y las crías fueron sacrificadas justamente al inicio de la etapa de desarrollo alveolar, por lo que consideramos que con la metodología empleada se limitó la apropiada evaluación de la alveolarización, ya que si bien se ha informado recientemente que las técnicas de evaluación alveolar que se utilizaron aquí, el RAC y el MLI, ofrecen amplia confiabilidad para estimar el número y las características morfométricas de estas estructuras

121

, se considera que tanto el momento, como la vía de nacimiento,

así como el que no hayan presentado esfuerzo respiratorio, influyó en forma negativa en esta evaluación. Se descarto interacción entre los grupos de estudio, mediante un modelo de regresión, la administración prenatal de sildenafil (grupo 3) no modifico la cantidad de bronquiolos terminales, mientras que el grupo 4 que recibió bosentán, mostró incremento significativo de los mismos. Así mismo el grupo que recibió bosentán (grupo 4) no modifico el espesor de la pared arterial, como se observo en el grupo 3 que recibió sildenafil.

47

CONCLUSIONES

 Se logró reproducir fielmente el modelo de HDC.  El tratamiento prenatal con sildenafil atenúa la remodelación vascular pulmonar en la HDC.  La administración prenatal de bosentán, incrementa la densidad de los bronquiolos terminales.  El bosentán mejoró la arquitectura pulmonar.  La combinación de ambas intervenciones farmacológicas, sildenafil y bosentán, promueve la formación de vías respiratorias terminales y atenúa el incremento en el espesor de la pared arterial pulmonar.  En el presente trabajo y con la metodología empleada no se encontró mejoría en la alveolarización.

48

PERSPECTIVAS

El presente trabajo de tesis, en el cual se ha logrado desarrollar el modelo experimental de HDC, brinda la apertura de una línea de investigación acerca de intervenciones farmacológicas prenatales en esta grave patología de elevada mortalidad, como la administración de fármacos que biológicamente no representen ningún tipo de riesgo en humanos, especialmente en mujeres gestantes, ya que a partir de los hallazgos comentados previamente, se plantea la posibilidad de probar otros compuestos como la L-citrulina, aminoácido no esencial, precursor del óxido nítrico que representaría una innovadora propuesta para atenuar cambios morfológicos característicos de esta patología, especialmente en remodelación vascular. Con base a las sugerencias obtenidas en presentaciones de resultados preliminares en foros nacionales e internacionales, así como en seminarios de investigación, se plantea

la

posibilidad

de

utilizar

herramientas

metodológicas

alternativas

especialmente en la evaluación patológica, que ofrecen mayor precisión como la técnica de inmunohistoquímica para evaluar cuantitativamente fibrosis intersticial

118,

119

. Así mismo existe la posibilidad de determinar expresión del factor de crecimiento

vascular endotelial en el parénquima pulmonar de los bloques cardiopulmonares embebidos en parafina de los cinco grupos de estudio, mediante RT-PCR (por sus siglas en inglés: Trascripción reversa – reacción en cadena de la polimerasa) igualmente, evaluar la expresión de endotelina

123

122

,

y elastina, esta última es una

proteína de matriz extracelular, responsable de la elasticidad vascular

124

y se

determinarían mediante el mismo método. Recientemente se ha reportado mayor objetividad y precisión en las mediciones cuantitativas y morfológicas de espacios aéreos, paredes de los mismos, bronquiolos y vasos mediante mediciones estereológicas

120

. La estereología es una ciencia

multidisciplinar que dicta reglas de muestreo geométrico para estimar cantidades definidas en objetos espaciales (como estructuras biológicas o minerales), tales como volúmenes, número de células, poros o inclusiones, superficies, longitud de fibras, filamentos o dendritas neuronales, por mencionar algunas

125

. Con los 49

avances en la tecnología, actualmente existen múltiples alternativas metodológicas aplicables a la presente línea de investigación. Se ha integrado el primer “borrador” del manuscrito con fines de enviar a evaluación para su publicación, actualmente en revisión por parte del grupo de investigación.

50

ANEXO 1

51

ANEXO 2

52

ANEXO 3

53

ANEXO 4

54

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