VALIDACION DE METODOS ANALITICOS

Dra. Samantha Cardozo Gestión de Laboratorio

OBJETIVOS • Aprender la metodología para la validación de las técnicas cuantitativas. • Reconocer los tipos de error involucrados en las mediciones. •Conocer las diferentes metodologías para analizar las variables que deben tener los métodos analíticos

VALIDACIÓN: Es un proceso de evaluación de las características de rendimiento de un procedimiento de medida y comprobación de que dichas características cumplen una serie de requisitos preestablecidos. Validación es la confirmación mediante el suministro de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos para una utilización o aplicación específica prevista (IRAM 32)

¿Qué requiere la validación? EQUIPAMIENTO que funcione y que esté calibrado correctamente

OPERADOR competente en ese campo de trabajo y con el conocimiento suficiente para tomar decisiones apropiadas

MÉTODOS documentados. ESTÁNDARES DE REFERENCIA confiables. Integridad de la MUESTRA.

Muchos de los parámetros de la aptitud del método que se asocian con la validación son de hecho evaluados, como parte del desarrollo del método

Muy frecuentemente no es posible determinar exactamente dónde termina el desarrollo de un método y dónde comienza la validación de ese método

¿Por qué es necesario validar un método? Porque debemos poder determinar un resultado correcto y ser capaz de demostrar que es correcto Esto es fundamental cuando la medición analítica es importante (costo, salud, remediación, legal, etc.)

Virtualmente, cualquier aspecto de la sociedad se respalda de algún modo por una medición analítica. LA VALIDACIÓN PROPORCIONA SEGURIDAD Y CONFIANZA

¿Por qué es necesario validar un método? Por la obligación profesional del analista El cliente espera confiar en los resultados informados y generalmente los cuestiona cuando aparece algún conflicto. Por la confianza con que el cliente necesita tomar decisiones en base a los resultados analíticos → aquí se debe validar la aptitud del método y estimar la incertidumbre del resultado de un modo que sea ampliamente reconocido, internamente consistente y fácil de interpretar. La toma de muestras: si el laboratorio no puede tomar la muestra o no tiene influencia sobre ello, los resultados deben informarse sobre la base de las muestras como fueron recibidas y destacar este hecho en el informe

¿Cuándo debería validarse un método? Cuando se necesita verificar que sus parámetros de aptitud son adecuados para usar para un problema analítico particular. Ejemplos: • Cuando se desarrolla un método nuevo • Cuando se revisa un método ya establecido para mejorar o extender a un nuevo problema • Cuando el control de calidad indica que el método en uso está cambiando con el tiempo • Cuando se usa un método ya establecido en un laboratorio diferente o con diferente analista o con diferente instrumental • Para demostrar la equivalencia entre 2 métodos, por ej. Un método nuevo y uno validado.

1. El laboratorio que usa un método es responsable de asegurar que está adecuadamente validado. 2. Si se usa un método normalizado validado, el usuario solamente necesita establecer los datos de aptitud para el uso propio del método. 3. Validación mediante un estudio colaborativo. Es el modo preferido de realizar la validación de un método. Cuando no es posible participar en interlaboratorios para validar el método, surgen las siguientes preguntas: ¿pueden los laboratorios validar métodos por su cuenta, y cómo? ¿pueden estos métodos validados ser reconocidos por otros laboratorios? ¿Qué clase de reconocimiento se puede esperar para los métodos caseros usados en un ámbito regulatorio? Ante un requisito regulatorio, un método analítico “casero” debería demostrar: - las tolerancias de todas las mediciones realizadas (volumen, temperatura, masas, etc.) - el efecto de las interferencias y su cuantificación - las fuentes significativas de error y los métodos para controlarlas

Analizando las características de rendimiento y estimando la magnitud de los errores que los mismos tienen asociados.

ERROR SISTEMÁTICO O DETERMINADO E.S. CONSTANTE E.S. PROPORCIONAL

ERROR ALEATORIO O INDETERMINADO

Ocurre siempre en el mismo sentido. Fácil de detectar, hallar su fuente y corregirlo.

EXACTITUD

ALEATORIO O INDETERMINADO

Se producen al azar. No pueden evitarse. Pueden disminuirse.

PRECISIÓN

CONSTANTE (1) su magnitud se mantiene al variar la cantidad medida en el espécimen g/L EXPERIMENTOS DE INTERFERENCIA

EXACTITUD

(1) Valor real

PROPORCIONAL (2)

Su magnitud es proporcional a la cantidad medida. EXPERIMENTOS DE RECUPERACIÓN

(2)

c

ERROR TOTAL = ES + EA Máxima inexactitud que se puede cometer en condiciones analíticas.

Experimentos de evaluación Tipo de error analítico Preliminares Error aleatorio

Replicación intraensayo con materiales puros y muestras reales

Error sistemático constante

Interferencias

Error sistemático proporcional

Recuperación

Finales Replicación interensayo con muestras reales

Comparación con un método probado

Esquema propuesto por Westgard y col.

DETERMINACIÓN DEL ERROR ALEATORIO Estudio preliminar Determinar la REPLICACIÓN INTRAENSAYO O EN EL DÍA. * Primero con una solución testigo, * luego con un suero o muestra control (preferentemente una de concentración baja y otra alta. * Analizar por lo menos 20 veces en forma continua (intraserial o intracorrida) o 20 veces en el transcurso del día (24 h) (intradía).

DETERMINACIÓN DEL ERROR ALEATORIO Estudio preliminar Calcular media, desviación estándar y coeficiente de variación

X = Σ X/n S=

Σ ( X – X )2 n-1 CV = S x 100 / X

CRITERIOS DE ACEPTACIÓN A) Para resultados a corto plazo (intraensayo)

S intraensayo ≤ 0.25 ETA

ó 4 S < ETA

DETERMINACIÓN DEL ERROR ALEATORIO ESTUDIO FINAL Evaluar la precisión interensayo del método durante 20 días. Se procesa la muestra control durante 20 días por duplicado y se calcula el desvío estándar

S=

Σ d2 2 (n – 1)

d = X1 – x2

S interensayo < 0.33 ETA

DETERMINACIÓN DEL ERROR ALEATORIO ESTUDIO FINAL Se comparan los resultados obtenidos con el método en estudio con otro de performance conocida y aceptada.

Comparación de precisiones: Se comparan las varianzas del método conocido con las del método en estudio mediante la prueba F: Fexp ≤ S2 mayor S2 menor

Si se cumple que el valor hallado es mayor que el F de tablas, las varianzas difieren

DETERMINACIÓN DEL ERROR SISTEMÁTICO

ESTUDIO PRELIMINAR:

A)Evaluación del error constante mediante DETERMINACION DE INTERFERENCIAS B) Evaluación del error proporcional mediante DETERMINACION DE RECUPERACIÓN

DETERMINACIÓN DEL ERROR SISTEMÁTICO CONSTANTE DETERMINACION DE INTERFERENCIAS 1º) Se agrega una cantidad conocida del interferente a estudiar Cálculo de la concentración de interferente agregado:

Conc. Int. = Conc. Estándar x Vol Agregado Vol Total 2º) Se determina la concentración del analito en una muestra sin interferente y con el agregado de interferente 3°) Se calcula la diferencia entre los resultados obtenidos .

EC = X - Xi

EC: Error constante X: Resultado sin interferente Xi: Resultado con interferente

DETERMINACIÓN DEL ERROR SISTEMÁTICO CONSTANTE DETERMINACION DE INTERFERENCIAS

4º) Se evalúa si la diferencia de los resultados es aceptable o no.

EC = X - Xi Criterio de aceptabilidad:

EC < ETA

DETERMINACIÓN DEL ERROR SISTEMÁTICO PROPORCIONAL ESTUDIO DE LA RECUPERACIÓN Permite evaluar el error sistemático cuya magnitud se incrementa a medida que crece la concentración del analito, es decir, el error sistemático proporcional. Consiste en agregar una cantidad exactamente conocida del analito, a una muestra de una paciente y luego determinar la cantidad recuperada mediante el método en estudio

DETERMINACIÓN DEL ERROR SISTEMÁTICO PROPORCIONAL ESTUDIO DE LA RECUPERACIÓN 1º) Se agrega a la muestra una cantidad conocida del analito a determinar

Conc. Anal. = Conc. Estándar x Vol Agregado / Vol Total 2º) Se calcula la concentración del analito recuperada haciendo la diferencia entre el valor obtenido sin analito agregado y con analito. 3º) Se calcula el Error proporcional.

EP = (R – 100) x Xc 100

R: Diferencia entre resultado con analito agregado menos muestra basal Xc: Concentración basal

Criterio de aceptabilidad:

EP < ETA

DETERMINACIÓN DEL ERROR SISTEMÁTICO PROPORCIONAL ESTUDIO DE LA RECUPERACIÓN El volumen agregado debe ser < 10% del volumen de la muestra

% de Recuperación = Cantidad recuperada / Cantidad añadida

La diferencia entre el % R ideal (100%) y el % R encontrado se puede considerar como estimación del Error Sistemático Proporcional (ES %)

Criterio de aceptabilidad:

EP < ETA

DETERMINACIÓN DEL ERROR SISTEMÁTICO ESTUDIO FINAL Se determina calculando la diferencia, bias o sesgo de los resultados de una muestra obtenidos con el método estudiado y el de comparación

Se procesan como mínimo 40 muestras de diferentes pacientes, abarcando el rango de concentraciones de trabajo lo más amplio posible. Por duplicado, por ambos métodos, 2 a 4 muestras por día durante 20 días.

ANALISIS DE RESULTADOS: Cmc - Cme x x

1 ) Gráficamente

Cme

x

x x

x

x x x Cmc

2 ) Cálculo del sesgo

ES = Σ (yi – xi) n S dif = ±

t = sesgo x S dif

Cmc

Promedio de las diferencias

Σ [ (yi – xi) - sesgo]2 n-1

n Si el valor absol de texp > t crít existe diferencias entre los métodos

y = a + bx

ANALISIS DE RESULTADOS: y

3 ) Análisis de Regresión

y = a + bx

y = bx

x

a: ordenada al origen (error constante) b: pendiente (error proporcional, cuando no hay error proporcional b=1)

4 ) Coeficiente de correlación Coeficiente de correlación: r puede valer entre –1 y +1 pasando por 0 y x y y x x x x x x x x x x x x x x x

r=0

x

x

x r = +1

x

r = -1

Rango de respuesta lineal. Sensibilidad Límite de detección Límite de cuantificación Precisión Exactitud Especificidad. Libertad de interferencias

El funcionamiento del método es ACEPTABLE cuando la magnitud de los errores observados es menor que el error medicamente permisible.

Error total permisible Desviación estándar permisible Error sistemático, sesgo o permisible.

bias

Ea + Es Ea Es

Lo ideal es trabajar con el ERROR TOTAL PERMISIBLE CRITERIOS CLIA: • Concentración (1 mg/dl) • Porcentaje (10 %) • De las dos formas anteriores (para glucosa el criterio es 6 mg/dl o 10 %) TONKS Basado en el intervalo de referencia, se calcula como:

EMT:

¼ Intervalo de Referencia a . x 100 Valor promedio del intervalo de referencia

Se acepta un máximo de 10% para los analitos y un máximo de 20% para las enzimas

RANGO DE RESPUESTA LINEAL (o Rango dinámico) La linealidad se define como la capacidad de un método para generar respuestas que son directamente proporcionales a la concentración del analito en las muestras dentro de un determinado rango.

RANGO DE RESPUESTA LINEAL PASOS: • Decidir intervalo de concentraciones de interés • Construir curva de calibrado estándares acuosos de cuatro o cinco niveles de concentración. • Procesar por triplicado blanco y estándares • Graficar Abs (y) versus Conc (x) y aplicar Regresión lineal • Calcular coeficiente de regresión de Pearson (r) • r > 0.99 indica buena correlación lineal

SENSIBILIDAD La sensibilidad de un instrumento o método se define como, su capacidad para discriminar entre pequeñas diferencias en la concentración de un analito. Es el cambio de la respuesta del instrumental que se corresponde con el cambio de la concentración del analito. • La IUPAC, define la sensibilidad como la pendiente de la curva de calibración a la concentración de interés. • La sensibilidad viene limitada por la pendiente de la curva de calibración y la reproducibilidad o precisión del sistema de medida. • Para dos métodos que tengan igual precisión, el que presente mayor pendiente en la curva de calibración será el más sensible

LIMITE DE DETECCION (XLD) Es la cantidad más pequeña de un analito a examinar en una muestra, que puede ser detectada y considerada como diferente de un blanco, pero no necesariamente cuantificada con un valor exacto. Es la cantidad de analito que proporciona una señal igual a la del blanco más tres veces la desviación estándar del blanco:

XLD = Xb + 3 S Xb es el valor promedio del blanco S = es la desviación estándar del blanco

LIMITE DE CUANTIFICACION (XLQ) Es la cantidad más pequeña de un analito a examinar en una muestra, que puede ser determinada cuantitativamente en las condiciones descriptas en el método. Se define como la cantidad de analito que proporciona una señal igual a la del blanco más diez veces la desviación estándar del blanco

XLQ = Xb + 10 Sb

PRECISION (XLD) Grado de concordancia entre un grupo de resultados obtenidos al aplicar repetida e independientemente el mismo método analítico a la misma muestra. El valor numérico que se obtiene corresponde a la imprecisión, estimada a través de la desviación estándar o el coeficiente de variación.

Repetibilidad

Reproducibilidad

REPETIBILIDAD Imprecisión obtenida a partir de ensayos realizados sobre alícuotas de la misma muestra en las mismas condiciones experimentales.

Mismo método Mismo laboratorio Mismo operador Mismo equipamiento Intervalo corto de tiempo Variabilidad aleatoria intracorrida r = 2,90 s DE intraserial o DE intradía ≤ 0,25 ET (error total permitido)

REPRODUCIBILIDAD Imprecisión obtenida a partir de ensayos realizados sobre alícuotas de la misma muestra en distintas condiciones experimentales. Mismo método Misma muestra Diferente laboratorio Diferente operador Diferente equipamiento Intervalo largo de tiempo Variabilidad aleatoria intracorrida + variabilidad aleatoria intercorrida R = 2,90 s DE interserial ≤ 0,33 ET (error total permitido)

EXACTITUD Grado de concordancia entre el resultado de la medición y el valor de referencia aceptado.

Exactitud=

Valor de Referencia – Valor obtenido Valor de referencia

. x 100

ESPECIFICIDAD Es la capacidad de un método para medir cuantitativamente la concentración de un analito, con la seguridad de que la señal medida proviene solamente del analito considerado. Experimento de especificidad. Libertad de interferencias Permite estimar el error sistemático constante causado por otros materiales que pueden estar presentes en la matriz de la muestra. Interferentes endógenos: •Hb •BRR •Lípidos •Proteínas

Interferentes exógenos: •Medicamentos •Aditivos como anticoagulantes

EJEMPLOS PARA LA EVALUACIÓN DE PARÁMETROS 1. - Ejemplo de Evaluación de la linealidad Suponer que se va a evaluar la linealidad de un método analítico para la determinación de colesterol, el fabricante del equipo menciona que el método es lineal en el intervalo de 40 a 430 mg/dl. Lo primero que se debe hacer es buscar controles o muestras muy cercanas a estos límites, de preferencia por abajo del menor y por arriba del superior, sin embargo esto último no debe ser considerado un requisito o una limitante. Decidir si se hará con calibradores, con sueros control o con muestras; únicamente si no se pueden tener calibradores ni sueros control se optará por utilizar muestras de pacientes

EJEMPLOS PARA LA EVALUACIÓN DE PARÁMETROS 1. Evaluación de la linealidad Se realizará la determinación de colesterol en la misma fecha y en el mismo equipo con dos muestras, una de concentración igual a 50 mg/dL (M1) y otra de 410 mg/dL (M2). Se preparan diluciones, de acuerdo a la tabla 1. N°de dilución

% Dilución (M2)

Porción en volumen de la M1

Porción en volumen de la M2

1

0

Usar sin diluir

0

2

25

3

1

3

50

2

2

4

75

1

3

5

100

0

Usar sin diluir

EJEMPLOS PARA LA EVALUACIÓN DE PARÁMETROS 1. - Evaluación de la linealidad Se realizan al menos tres mediciones de cada dilución y se tabulan los datos (supuestos) como en la tabla siguiente.

N°de dilución

Mediciones de concentración

Media

1

2

3

1

47

49

48

48

2

035

135

137

135,6

3

230

233

236

233

4

330

322

329

327

5

401

407

399

402,3

EJEMPLOS PARA LA EVALUACIÓN DE PARÁMETROS 1. - Evaluación de la linealidad Se grafica la media de las replicas sobre el eje Y, contra el valor conocido (calibradores) o asignado (sueros control o muestras) sobre el eje X. Con el método de mínimos cuadrados, se calcula la ecuación de la recta de regresión para los puntos dados y el coeficiente de correlación.

r2 = 0,9983

El valor r2 0,9984 del coeficiente indica que en el intervalo evaluado, la función de calibración es lineal

EJEMPLOS PARA LA EVALUACIÓN DE PARÁMETROS 2- Evaluación de sesgo y % de error

N°de dilución

Media, valores prácticos y

Valor teórico x

Sesgo

% error

1

48

50

2

4,0

2

135,6

138,2

2,6

1,88

3

233

230

3

1,3

4

327

320

7

3,0

5

402,3

410

7,7

1,87

V de R – Val obt.. x 100 V de R

Finalmente, se compara el sesgo (desviación) o el porcentaje de error para cada dilución con el error permitido para la prueba, de acuerdo con la información del fabricante o del método, donde el sesgo (desviación) y % de error debe ser menor que el error permitido y a partir de esta comparación se toma la decisión de aceptabilidad o rechazo.

BIBLIOGRAFIA Cámara, M.; Nepote, J.; Nejman, N. y Gómez Ayet, M.: “CONTROL Y EVALUACIÓN DE LA CALIDAD EN EL LABORATORIO DE ANÁLISIS CLÍNICOS”. Corrientes, 2003. Selles, J. Y Marigliano, R.: “CURSO VALIDACION DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA DIAGNÓSTICOS”. CONCEPTOS Y FUNDAMENTOS ESTADÍSTICOS”. 2004. Sobrero, C. y Malbrán, T.: “CURSO DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD EN EL LABORATORIO DE ANÁLISIS CLINICOS”. Resistencia, 2001. http://www.ema.org.mx/descargas/guias_tecnicas/ensayos_clinicos/la boratoriosclinicosv00.pdf http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/lhh345a/InstrumentalLecc1.p df