Identificación Histológica y Molecular del Parásito Protozoario Marteilia en la Glándula Digestiva de Digitaria digitaria (L. 1758) (Mollusca: Bivalvia)

Alfonso Ascenzo Navarro

Universidad de Málaga 2014

Universidad de Málaga

Dpto. de Biología Animal & Dpto. de Biología Celular, Genética y Fisiología (Área de Genética) Facultad de Ciencias

Profª. Dra. Dª. Carmen Salas Casanova, Profesora Titular de Zoología de la Universidad de Málaga (Facultad de Ciencias). Profª. Dra. Dª. Ana Grande Pérez, Profesora Titular de Genética de la Universidad de Málaga (Facultad de Ciencias).

HACEN CONSTAR: Que el presente trabajo ha sido realizado bajo su supervisión y recoge de forma precisa la labor realizada por D. Alfonso Ascenzo Navarro como trabajo final del Máster en Biotecnología Avanzada. La labor experimental se ha llevado a cabo en el Dpto. de Biología Animal y en el Dpto. de Biología Celular, Genética y Fisiología (Área de Genética) de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Málaga.

(12/11/2014) LA TUTORA DEL TRABAJO Fdo. Dra. Carmen Salas Casanova

(12/11/2014) LA TUTORA DEL TRABAJO Fdo. Dra. Ana Grande Pérez

ÍNDICE

Introducción ............................................................................................................. 1 Objetivos .................................................................................................................. 4 Material y Métodos .................................................................................................. 4 Material procesado ..........................................................................................................4 Medios utilizados .............................................................................................................5 Procesamiento histológico ...............................................................................................5 Procesamiento Microscopia Electrónica de Barrido Ambiental (ESEM) ..............................7 Disección de los ejemplares y extracción de ADN ..............................................................7 Preparación “Células Competentes” DH5α........................................................................7 Amplificación por PCR ......................................................................................................8 Clonación y secuenciación .............................................................................................. 11

Resultados ............................................................................................................. 13 Observaciones histológicas y ESEM................................................................................. 13 Caracterización molecular región ITS-1 e IGS................................................................... 19

Conclusión .............................................................................................................. 26 Bibliografía ............................................................................................................ 27

Introducción

El phylum Paramyxea, comprende a diversos parásitos protistas que poseen la peculiaridad de dividirse internamente mediante la formación de esporas, una dentro de otra, a raíz de una sola célula madre (Desportes & Perkins, 1990). Mediante análisis ultraestructurales de Mytilus edulis y Ostrea edulis, se demostró que el primer estadio de Martelia en aparecer es el de una célula primaria incluyendo una secundaria, dividiéndose esta última para producir 8 células secundarias (o preesporangios). Cada preesporangio acaba formando 4 células terciarias (o esporas) por división interna, dividiéndose estas últimas también por división interna, para finalmente producir esporas maduras (Longshaw et al., 2001). Las esporas maduras consisten de 3 esporoplasmas (externo, intermedio e interno) uno dentro de otro (Perkins, 1976). La enfermedad conocida como Marteiliosis fue descrita por primera vez en ostras del suroeste francés y al agente causante de este enfermedad se le denominó Marteilia refringens (Grizel et al., 1974). Unos años más tarde, se identificó una nueva especie de Marteilia, M. maurini, en el mejillón Mytillus galloprovincialis de la laguna de Venecia, Italia (Comps et al., 1982). Los criterios para establecer si se trataba de una especie u otra estaban basados en caracteres ultraestructurales (microscopía óptica y electrónica) y en una especificidad de hospedador, habiéndose encontrado siempre y hasta el momento M. refringens en ostras y M. maurini en mejillones (Comps et al., 1982; Auffet & Poder, 1983). Una década después, M. refringens se identificó en mejillones (Villalba et al., 1993; Robledo & Figueras, 1995), con lo cual el argumento del hospedador para discriminar entre una especia u otra quedaba totalmente inválido. M. refringens ha sido el agente responsable de grandes pérdidas económicas en la industria ostrícola a lo largo de los años, tanto en Francia como en España, concretamente ha causado grandes mortalidades de la ostra plana (Ostrea edulis) (Alderman et al., 1979). A su vez, M. sidneyi también ha sido identificada como responsable de causar grandes mortalidades en las poblaciones de la ostra Crassostrea glomerata en Australia (Adlard & Ernst, 1995). Debido a esto, los parásitos del género Marteilia han sido reconocidos por la Organización Mundial de Epizootia (O.I.E código 2000) como patógenos importantes de moluscos bivalvos en Europa. 1

Debido a que los criterios ultraestructurales y de especificidad de hospedador dejaron de ser discriminatorios en el reconocimiento de las diferentes especies, se empezó a hacer uso de la taxonomía molecular y para ello, en gran medida, del DNAr (DNA ribosómico). El DNAr, cuya estructura se presenta en la Figura 1, es secuenciado para discriminar entre especies y calcular divergencias, especialmente el espaciador transcrito interno (ITS), muy utilizado para el diagnóstico molecular de parásitos, ya que suele ser especie-específico (Dlugosz & Wisniewski, 2006). La región ITS suele ser una región donde se ejerce una presión evolutiva menor, con lo cual, la posible variabilidad nucleotídica entre las secuencias aumenta (Page & Holmes, 1998). De hecho, la región ITS-1 del DNAr de M. refringens posee polimorfismo genético mediante RFLP, distinguiéndose de esta manera 2 tipos de M. refringens: Tipo O, encontrada en ostras y tipo M, encontrada en mejillones (López-Flores et al., 2004). Esto último modifica lo previamente publicado de que estos 2 tipos pertenecen a 2 especies diferentes de Marteilia, M. refringens en ostras y M. maurini en mejillones (Le Roux et al., 2001). Otras dos regiones muy usadas del DNAr son las regiones 18S o subunidad menor del DNAr (DNAr SSU) y la región IGS. La región 18S es una región altamente conservada entre especies eucariotas (Gerbi, 2003). Cuando se secuenció esta región, se vio que el género Marteilia no estaba estrechamente relacionado con ningún otro filo eucariótico y que por eso los Paramyxea debían tener la categoría taxonómca de “filo” (Berthe et al, manuscrito). En comparación, la región IGS es la más variable de las tres mencionadas y mediante una PCR-RFLP, sirve para distinguir entre M. refringens y M. cochillia, una nueva especie de Marteilia encontrada en el berberecho común Cerastoderma edule (Carrasco et al., 2012).

Fig. 1. Representación esquemática del DNAr de Marteilia. ITS, Espaciador Transcrito Interno. IGS, Espaciador Intergénico. 18S (SSU), subunidad menor del DNAr.

Digitaria digitaria (L., 1957) (Fig. 2) es un pequeño bivalvo de la familia Astartidae, de distribución Atlántico-Mediterránea, cuyo hábitat típico son los fondos

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de bioclastos con corrientes de fondo (Gofas et al. 2011). En el litoral andaluz se ha localizado poblaciones en el área del Estrecho de Gibraltar y el litoral de Mijas. Durante un estudio de la biología de esta especie (Pablo Marina, estudio en curso) se observó la presencia de un parásito en la glándula digestiva de muchos ejemplares, cuyas características se asemejaban a la de las especies del género Marteilia, lo que planteó la necesidad de identificar dicho parásito, con el fin de comprender mejor la biología de esta especie, en particular el papel del bivalvo como posible hospedador en el ciclo del parásito.

Fig. 2. Digitaria digitaria (L. 1758) del litoral de Mijas (Málaga) con colonias de hidrozoos en la zona posterior.

En este contexto se propuso el presente estudio, cuya hipótesis de trabajo es que el bivalvo D. digitaria es hospedador de al menos uno de los estadios del ciclo vital de una especie de Marteilia. Al vivir D. digitaria en fondos de más de 15 metros de profundidad sometido a corrientes de fondo, diferente pues del de las ostras, mejillones y berberechos, que son intermareales, cabe suponer que la especie debe ser nueva ya que el hábitat es diferente. Por otro lado, estos datos ayudarían a clarificar de alguna manera el insuficientemente conocido ciclo biológico de las especies del género Marteilia, las

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cuáles causan enormes daños en los criaderos de moluscos, así como a ampliar el listado de especies de Marteilia presentes en las costas europeas.

Objetivos

1. Demostrar la existencia de parásitos del género Marteilia en la glándula digestiva del molusco bivalvo D. digitaria mediante técnicas histológicas convencionales y de microscopía electrónica, apoyándonos en el uso de la bibliografía actual. 2. Comprobar por técnicas moleculares que dichos parásitos pertenecen al género Marteilia, para lo que extraeremos el DNA de glándulas digestivas de bivalvos D. digitaria infestadas con los parásitos, amplificaremos las regiones ITS-1 e IGS empleando

los

oligonucleótidos

publicados

para

Marteilia,

y

las

secuenciaremos para compararlas con las secuencias de dichas regiones del género Marteilia disponibles en GenBank.

Material y Métodos

Material procesado Para la identificación de parásitos del género Marteilia mediante histología y secuenciación, diez ejemplares del molusco bivalvo D. digitaria fueron recolectados el día 11/12/2013 en el litoral de Mijas (LIC de Calahonda), (Málaga, España). Seis de los ejemplares se fijaron en etanol al 70% y se guardaron a 4˚C hasta su posterior utilización en experimentos de secuenciación. Los restantes cuatro ejemplares se fijaron en formaldehído al 4% en agua de mar y se guardaron a temperatura ambiente para su posterior utilización en histología. Además, un ejemplar recolectado, fijado en glutaraldehído e incluido en parafina en el año 1994, se utilizó para la visualización mediante microscopía electrónica de barrido ambiental (ESEM). 4

Medios utilizados Tampón fosfato salino (PBS) 1X

Se disolvieron las siguientes sales en agua Milli-Q a las concentraciones indicadas: NaCl (137 mM), KCl (2,7 mM), Na2HPO4 (10 mM) y KH2PO4 (2 mM), se ajustó a pH 7,4 con HCl y se esterilizó por filtración.

Buffer de transformación 1 (TFB1)

Se añadieron los siguientes compuestos a las concentraciones indicadas: KOAc (30 mM); RbCl (100 mM); CaCl22H2O (10 mM); MnCl24H2O (50 mM); COCl2 (3mM) y glicerol (15%). A continuación se ajustó el pH a 5,8 con ácido acético 0,2 M y se añadió agua Milli-Q, se esterilizó por filtración y se guardó a 4˚C.

Buffer de transformación 2 (TFB2)

Se añadieron los siguientes compuestos a las concentraciones indicadas: MOPS (10 mM); CaCl22H2O (75 mM); RbCl (10 mM) y glicerol (15%). A continuación se ajustó el pH a 6,5 con KOH, se añadió agua Milli-Q, se esterilizó por filtración y se guardó a 4˚C.

Procesamiento histológico Limpieza y poli-L-lisinado de portaobjetos

Los portaobjetos se sumergieron en alcohol de 70˚ con HCl al 0,35 % durante 10 minutos. Posteriormente se lavaron los portaobjetos en agua destilada durante 5 minutos y se escurrieron mediante agitación. A continuación se sumergieron los portaobjetos en una solución de poli-L-lisina al 10% durante 5-10 minutos y para finalizar, se colocaron los portaobjetos en una estufa a 37˚C durante 4-5 horas.

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Inclusión en parafina de las muestras y elaboración de los bloques

Los 4 ejemplares fijados previamente en formaldehído fueron sometidos a una batería de deshidratación [agua destilada – 10 min (x3); alcohol etílico 30˚ - 15 min; alcohol etílico 50˚ - 15 min; alcohol etílico 70˚ - 15 min; alcohol etílico 80˚ - 15 min; alcohol etílico 90˚ - 15 min; alcohol etílico 96˚ - 15 min (x2); alcohol etílico 100˚ - 30 min (x2); alcohol butílico – 30 min (x2)] mediante la utilización de un casete en donde se introdujo la muestra. Una vez terminado el proceso de deshidratación, se procedió al proceso de inclusión en parafina (HISTOSEC, Merck Ref. 111609) que constó de los siguientes pasos: 1) Baño en alcohol butílico + parafina al 50% a 60˚C durante 40 min. 2) Baño en parafina a 60˚C durante 60 min. 3) Baño en parafina a 60˚C durante 60 min. 4) Baño en parafina a 60˚C durante 60 min. Para la formación del bloque de parafina se utilizó un molde metálico que previamente se impregnó en glicerina para su posterior facilitación en el desmoldamiento.

Corte al microtomo de los bloques de parafina

Los cortes del bloque de parafina se realizaron mediante el micrótomo (LEICA RM 2125). Una vez obtenidos los cortes en tiras, estas se depositaron sobre los portaobjetos previamente poli-L-lisinados con la ayuda de un baño termostático a 37˚C. Finalmente, los portaobjetos con sus correspondientes cortes se secaron en una estufa a 37˚C durante 24 horas.

Tinción de secciones histológicas con Hematoxilina & Eosina y Hematoxilina- V.O.F

Para ello se sumergieron los portaobjetos con sus correspondientes cortes en una batería de alcoholes y colorantes, el orden y los tiempos fueron los siguientes: Xileno - 15 min (x3); alcohol 100˚ - 10 min (x2); alcohol 96˚ - 10 min (x2); alcohol 70˚ 10 min; alcohol 50˚ - 10 min; alcohol 30˚ - 10 min; agua destilada - 5 min (x2); Hematoxilina - 8 min; agua - 3 min; Tricrómico con: Light Green yellowish, Orange G y Fucsin acid (VOF) - 5 min; agua - 3 min; alcohol 70˚ - 5 min; alcohol 96˚ - 5 min; alcohol 100˚ - 5 min; eucaliptol - 15 min; xileno - 10 min. En 2 de los 4 ejemplares, se usó la 6

doble tinción de Hematoxilina - Eosina. Una vez culminó el proceso de tinción, se colocaron los cubreobjetos sobre los portaobjetos con la ayuda del pegamento DPX (Distyrene Plasticizer Xylene) y se introdujeron en una estufa a 45˚C durante 24 horas.

Procesamiento Microscopia Electrónica de Barrido Ambiental (ESEM) Para la visualización por ESEM, un individuo recolectado, fijado en glutaraldehído e incluido en parafina en el año 1994, se sumergió en dos baños de xylol de 3 horas el primero y 1 hora 50 minutos el segundo. Una vez se desparafinó la muestra, ésta se sumergió en 3 baños de etanol al 100% de 1 hora el primero, 1 hora el segundo y 20 horas el tercero para su consecuente deshidratación. Las muestras se procesaron en punto crítico

y posteriormente se visualizaron en el Microscopio

Electrónico de Barrido Ambiental (ESEM: FEI Quanta 250 FEG).

Disección de los ejemplares y extracción de ADN Para la extracción y purificación del ADN, se procedió primero con la disección de la glándula digestiva del resto del cuerpo del bivalvo mediante una lupa (LEICA MZ12). Una vez diseccionadas las glándulas digestivas de los 6 ejemplares, se extrajo y se purificó el ADN de estas mediante el kit QIAamp® DNA Mini Kit (Invitrogen, Carlsbad CA, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante (Protocolo de purificación de ADN desde tejidos). Treinta minutos antes de empezar con dicho protocolo, las glándulas digestivas se sumergieron en tampón fosfato salino (PBS), pH 7.4. El ADN extraído se cuantificó y se diluyó hasta obtener una concentración final de 100 ng/µl, finalmente se guardó a 4˚C para su utilización en pruebas posteriores.

Preparación “Células Competentes” DH5α Para la preparación de células competentes DH5α de Escherichia coli, se siguió el protocolo de preparación de células competentes mediante el método-RbCl (Cloruro de rubidio), para lo que se picó una colonia fresca de E. coli y se dejó crecer en medio

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LB (Luria-Bertani) a 37˚C en agitación durante toda la noche. Al día siguiente se diluyó 1/100 el cultivo en 200 ml de LB (previamente calentado a 37˚C) y se dejó crecer a 37˚C en agitación hasta que la OD600 fue de 0,25-0,3. Una vez se obtuvo la OD esperada, se incubó en hielo durante 5 minutos y se centrifugó a 3000 xg durante 5 minutos a 4˚C, a continuación se tiró el sobrenadante y el pellet se resuspendió en 40 ml de TFB1 (se pipeteó gentilmente), seguidamente, el pellet resuspendido se incubó en hielo durante 5 minutos y se centrifugó a 3000 xg durante 5 minutos a 4˚C, descartando el sobrenadante nuevamente y resuspendiendo el pellet en 4 ml de TFB2, lo cual se incubó en hielo durante 15 minutos. Pasados los 15 minutos se hicieron alícuotas de 250 µl que se congelaron en nitrógeno líquido y luego se guardaron a 80˚C.

Amplificación por PCR Optimización PCR región ITS-1

Con el objetivo de amplificar la región ITS-1 (Fig. 3) del DNAr de Marteilia, se utilizaron los oligonucleótidos M2A y M3AS (Tabla 1), correspondientes a los oligonucleótidos PR4 y PR5 respectivamente (Le Roux et al., 2001). Para comprobar la temperatura idónea de hibridación de los oligonucleótidos se realizó una amplificación por PCR en gradiente de temperatura (Termociclador TECHNE TC PLUS). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen final de 25 µl, con 0,5 µl de la enzima PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerasa (©Agilent Technologies), 2,5 µl 10X PfuUltra II reaction buffer, 2,5 µl de dNTPs (2mM c/u), 2,5 µl del oligonucleótido M2A (Tabla 1) a 10 µM, 2,5 µl del oligonucleótido M3AS (Tabla 1) a 10 µM y 50 ng de ADN del individuo 6. Como control negativo se utilizó 0,5 µl de agua libre de nucleasas en sustitución del ADN. El programa de la PCR en gradiente fue el siguiente: Desnaturalización inicial (94˚C, 10 minutos); 30 ciclos de desnaturalización (94˚C, 1 minuto), hibridación (53,1; 55,6; 57,3; 59,6; 62,4 ˚C, 1 minuto) y extensión (72˚C, 1 minuto); elongación final (72˚C, 10 minutos). Los productos de amplificación se separaron en un gel de agarosa al 1 %

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(en un buffer TAE 1X) teñido con SYBR® Safe (Life Technologies). Como DNA ladder se usó el 1Kb Plus (Life Technologies). Se utilizó sacarosa al 40% como buffer de carga. Para establecer la concentración idónea de DNA que debíamos utilizar en la amplificación por PCR, se llevó a cabo una PCR con distintas concentraciones de DNA (50 ng; 100 ng; 150 ng; 200 ng; 250 ng y 300 ng) del individuo 6. La mezcla de reacción y el programa de la PCR fueron idénticos a la anterior, excepto en las concentraciones de DNA y la temperatura de hibridación de los oligonucleótidos, donde se eligió la más óptima (57,3˚C). Por último, se probó una PCR con distintas concentraciones de MgCl2 (2mM, 3mM, 4mM y 5mM). La mezcla de reacción y el programa de la PCR fueron iguales que en la primera PCR, excepto en las concentraciones de MgCl2, la temperatura de hibridación de los oligonucleótidos, donde se volvió a elegir la más óptima (57,3˚C) y la concentración de DNA, donde se eligió también la más óptima (50 ng por cada 25 µl de volumen de mezcla de reacción).

Tabla.1. Oligonucleótidos usados en este estudio.

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Fig. 3. Representación esquemática del DNAr de Marteilia y los oligonucleótidos utilizados para amplificar cada región. ITS, Espaciador Transcrito Interno. IGS, Espaciador Intergénico. 18S (SSU), subunidad menor del DNAr.

Amplificación por PCR

Una vez hallados los parámetros y condiciones óptimas para amplificar la región ITS-1 del DNAr de Marteilia, se realizó una PCR con el ADN de los 6 individuos, usando la mezcla de reacción y condiciones del programa de PCR ambos optimizados en un volumen de reacción de 100 µl. De los 100 µl del producto de amplificación, 10 µl se usaron para comprobar las bandas obtenidas mediante un gel de agarosa al 1% teñido con SYBR® Safe, los 90 µl restantes del producto de amplificación de PCR se purificaron mediante el kit “Ilustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit” (GE Healthcare) siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación se midieron las concentraciones de ADN obtenidas de las 6 purificaciones. Para la amplificación de la región IGS (Fig. 3) del DNAr de Marteilia se utilizaron los oligonucleótidos MT-1/MT-2 (Tabla 1). La PCR se realizó en un volumen final de 100 µl, con 10 µl de 10X DreamTaq buffer, 10 µl dNTPs (2mM c/u), 10 µl de cada oligonucleótido a 10 µM, 2.5 U de la enzima DreamTaq DNA Polymerasa y 200 ng de DNA de cada uno de los 6 individuos. El programa de PCR usado fue el siguiente: Desnaturalización inicial (94˚C, 5 minutos); 30 ciclos de desnaturalización (94˚C, 1

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minuto), hibridación (55 ˚C, 1 minuto) y extensión (72˚C, 1 minuto); elongación final (72˚C, 10 minutos). Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa al 1% teñido con SYBR® Safe.

Clonación y secuenciación Región ITS-1

El producto de amplificación purificado previamente se sometió a una reacción de A-tailing durante 30 minutos a 70˚C. Los componentes de la reacción fueron los siguientes: 1µl 10X DreamTaq Buffer, 1 µl dATP (2mM), 5 U de la enzima DreamTaq DNA Polymerasa y 7 µl de DNA purificado. Una vez añadida la deoxiadenosina al 3’ terminal del inserto, se procedió a su ligación en el vector comercial pGEM® -T Easy Vector (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. La reacción de ligación se incubó a 4˚C durante toda la noche. Los productos de ligación se transformaron en células competentes DH5α previamente preparadas y siguiendo también las instrucciones del protocolo facilitado por “la casa comercial”. Debido a que el inserto era pequeño (412 pb) y la cantidad de colonias azules obtenidas fue muy superior a la de blancas, se seleccionaron colonias blancas y azules de cada uno de los 6 individuos y se diluyeron en 50 µl de agua Milli-Q. De estos 50 µl, 1 µl se usó en una reacción de “PCR de colonia” de 25 µl de volumen final, con 2,5 µl del primer del promotor T7 (5’TAATACGACTCACTATAGGG-3’) (10 µM), 2,5 µl del primer del promotor SP6 (5’GATTTAGGTGACACTATAG-3’) (10 µM), 2,5 µl 10X PfuUltra II reaction buffer, 2,5 µl de dNTPs (2mM c/u) y 0,5 µl de la enzima PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerasa, para posteriormente visualizar en un gel de agarosa al 1,5 % teñido con SYBR® Safe, la presencia de nuestro inserto (colonias positivas). El programa para la PCR de colonia fue el siguiente: Desnaturalización inicial (94˚C, 5 minutos); 30 ciclos de desnaturalización (94˚C, 30 segundos), hibridación (55˚C, 30 segundos) y extensión (72˚C, 30 segundos); elongación final (72˚C, 10 minutos). Una vez seleccionadas las colonias positivas, se procedió a amplificar el DNA plasmídico mediante el kit “Templihpi 100 Amplification Kit” (Amersham Biosciences, UK), siguiendo las

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instrucciones del fabricante y usando 1 µl de las colonias previamente diluidas en 50 µl de agua Milli-Q como muestra e incubando la reacción durante 18 horas a 30˚C. Una alícuota de 5 µl de DNA plasmídico amplificado mediante la reacción Templiphi se diluyó con agua Milli-Q en un volumen final de 10 µl, a lo que se le añadió 1 µl del primer del promotor T7 o 1 µl del primer del promotor SP6 para la posterior secuenciación (Stab Vida, Setubal, Portugal).

Región IGS

El producto de amplificación de la región IGS, se purificó de la misma manera como se hizo para la región ITS-1. Tras la purificación, se midieron las concentraciones de DNA de cada purificado y se envió directamente para secuenciación un volumen de 10 µl de DNA a una concentración de 50 ng/µl + 3 µl de uno de los dos oligonucleótidos (Individuos 1, 2 y 3 con oligonucleótido MT-1 e individuos 4, 5 y 6 con oligonucleótido MT-2) a una concentración de 10 pmol/µl.

Las secuencias obtenidas en este estudio correspondientes a las regiones ITS-1 e IGS del DNAr de Marteilia se alinearon con secuencias de estas mismas regiones de Marteilia descargadas de GenBank (Números de acceso: AJ629337.1, M. refringens ITS1 OedHue-32 ; AJ629341.1, M. refringens ITS-1 MgaHue-50 ; AJ629344.1, M. refringens ITS-1 MgaVigo-47 ; AJ629348.1, M. refringens ITS-1 MgaTri-32; AJ629351.1, M. refringens ITS-1 MgaVen-35; DQ426602.1, M. refringens ITS-1 I_Mu16.2 Partialseq; DQ426643.1, M. refringens ITS-1 G_Oy26.4 Partialseq; JN820089.1, M. refringens ITS-1 type C NC-2011 Partialseq; KC462435.1, M. refringens ITS-1 Mgallo1_1 Partialseq; KC462437.1, M. refringens ITS-1 Zoopl1_3 Partialseq; KF263919.1, M. refringens ITS-1 Clon MB10 Partialseq; AY324584.1, M. refringens ITS-1 Clon Mu_7.11 Partialseq; AY324587.1, M. refringens ITS-1 Oy_6.5 Partialseq; JQ898014.1, M. refringens ITS-1 type M clone11193_2c19 Partialseq; AJ629356.1, M. refringens partial IGS OedHue-37; AJ629362.1, M. refringens partial IGS MgaHue-33; AJ629369.1, M. refringens partial IGS MgaVigo-48; AJ629376.1, M. refringens partial IGS MgaVen-49; AM504141.1, M. refringens IGS Acartia italica-16; AM504143.1, M. refringens IGS Acartia discaudata-21; AM504144.1, M. refringens IGS Brachyura zoea-22; AM504145.1, M. refringens IGS 12

Oithona sp-25; AM292652.1, M. refringens partial IGS Chamelea gallina; AM504136.1, M. refringens IGS Zooplankton bulk-22; AM504137.1, M. refringens IGS Euterpina acutifrons-9; JQ066725.1, M. refringens partial IGS clon MR-CC18LP; KF314811.1, Marteilia sp. partial IGS clon 1KBA-2013). Para el alineamiento, cálculo de distancias y construcción de árboles filogenéticos se utilizó el software MegAlign del paquete DNAStar (Lasergene) mediante el método ClustalW. Para el análisis de los cromatogramas se utilizó el software SeqMan de este mismo paquete.

Resultados

Observaciones histológicas y ESEM De los 10 ejemplares recolectados el 11/12/13, 4 de ellos se fijaron en formaldehído al 4% en agua de mar para ser procesados histológicamente, encontrándose en los 4 ejemplares una infección grave de intensidad 5 según la escala de infección por marteiliosis propuesta por Villalba et al. (1993). Todos los epitelios de los túbulos digestivos observados en los 4 ejemplares estaban infestados por parásitos del género Marteilia de tamaños variables (Figs. 4-9), obteniéndose una prevalencia de infestación del 100% (4/4). ). En uno de los ejemplares se observó la presencia de larvas redias de platelmintos trematodos entre los túbulos de la glándula digestiva (Fig. 4). La visualización de los cortes a 40X permitió identificar la formación de posibles células secundarias (preesporangios) dentro de la célula primaria (Fig. 5,6 y 8). Cuando las tinciones se realizaron con hematoxilina – V.O.F, las células de mayor tamaño se tiñeron de un color más oscuro, mientras que las de menor tamaño lo hicieron de un tono más claro, permitiendo en este último caso una mejor observación de posibles células secundarias en su interior (Fig. 6). En algunos cortes se pudo observar que el parásito se hallaba incluso en el epitelio del estómago (Fig. 7), además, se observó la posible liberación de una célula de Marteilia (incluida en una célula epitelial del túbulo digestivo) a la luz de un túbulo de la glándula digestiva (Fig. 9). Dichas células de Marteilia incluidas en células epiteliales se hallaron también en la luz del estómago en algunos cortes (Fig. 10).

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Fig. 4. Sección histológica a microscopía óptica (20X) teñida con hematoxilina – V.O.F donde se aprecian gran cantidad de células (flecha) de Marteilia en el epitelio (asterisco) de la glándula digestiva de D. digitaria. Nótese la diversidad de tamaños de las células de Marteilia, además de la presencia de larvas redias (estrella) de platelmintos entre los túbulos de la glándula digestiva. Escala = 10 µm.

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