Quinolonas: mecanismo de acción
FLUOROQUINOLONAS -I
Ingreso a la célula a través de porinas
Sitio de acción: topoisomerasas tipo IIA i) ADNgirasa: GyrA-GyrB ii) Topoisomerasa IV: ParC-ParE
MECANISMOS DE ACCION Y RESISTENCIA
A
A
B B
Sitio primario bacilos Gram(-): ADNgirasa Separación cadenas ADN: replicación, reparación, transcripción
Marcelo Galas Departamento Bacteriología Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, Buenos Aires
Super-enrrollamiento positivo
ADNgirasa y Topo IV:
Replicación de ADN
Baja a moderada
ADN girasa
1
ABSORCION
AUC CIP 750x2 mg vo CIP 500x2 mg vo CIP 400x2 mg p CIP 400x3 mg p
NOR 1,5 µg/ml (400 mg vo) CIP 3,0 µg/ml (750 mg vo) CIP 1,5 µg/ml (500 mg vo) CIP 1,0 µg/ml (250 mg vo) CIP 0,4 µg/ml (100 mg vo) GAT 4,3 µg/ml (400 mg vo) LEV 6 µg/ml (500 mg vo) MOX 4,5 µg/ml (400 mg vo)
Célula bacteriana
i) Unión al ADN ii) Cortan una cadena iii) Pasan la otra cadena por el gap iv) Unen la cadena cortada
NOR 15% CIP 30% GAT 20% LEV 30% MOX 40-50%
CMAX
Super-enrrollamiento negativo
Cromosoma
3
Células hijas
Separación de los cromosomas
EJEMPLOS
1º Generación
A. nalidíxico, A. oxolínico, A. pipemídico, Cinoxacina
2º Generación
Norfloxacina, Ciprofloxacina, Lomefloxacina, Ofloxacina, Levofloxacina
Excreción
NOR 3,3 h CIP 3-4 h GAT 7-10 h LEV 6 h MOX 8-15 h
Renal y biliar Altas concentraciones en orina de droga no modificada para casi todas las quinolonas.
Quinolonas: mecanismos de resistencia
Clasificación de Quinolonas CLASE
Buena penetración a Tejidos ↑↑ CC intracelular (Moderada LCR, hueso y tej. ocular)
T1/2 Cromosoma duplicado
35 20 25 40
DISTRIBUCION QUINOLONAS
2
Relajan tensión del superenrollamiento Topoisomerasa generada por IVseparación de cadenas
B
UNION A PROTEINAS
Todo proceso celular de separación de cadenas de ADN: 4
B
NOR 50% CIP 70% GAT 96% LEV 95-100% MOX 86-100%
ADN polimerasa
Cadena líder
A
Biodisponibilidad entre 50 y 100%
Primers de ARN
Cadena retrasada
A
Efecto: bloquean acción de ADNgirasa y Topo IV, induciendo fragmentación de ADN (sistema SOS) y muerte celular
ESPECTRO ANTIMICROBIANO Enterobacterias Enterobacterias, P. aeruginosa, algunos Gram(+), algunos patógenos atípicos
A. Mecanismos “clásicos” de resistencia: mutaciones cromosómicas (no transferibles) 1. Alteración de sitios blanco de las drogas: mutaciones en regiones QRDR (Quinolone Resistance Determining Region) de genes gyrA, gyrB, parC, parE QRDR ~ 240 pb
GyrA aa 60 3º Generación
Esparfloxacina, Gatifloxacina Enterobacterias, Gram(+) (SPN), Grepafloxacina, Tosufloxacina, patógenos atípicos, Temafloxacina, +/- actividad sobre anaerobios
4º Generación
Moxifloxacina,Gemifloxacina, Enterobacterias, P. aeruginosa Trovafloxacina, Clinafloxacina, Gram(+) (SPN), patógenos atípicos Sitafloxacina y ↑ actividad sobre anaerobios Andriole y col., Clin Infect Dis 41: S113-9, 2005
2634 pb
gyrA Mutaciones más frecuentes:
Ser83Phe-Tyr-Ala
aa 140 Asp87Gly-Asn-Tyr
2. Disminución de concentración citoplasmática de las drogas: b) Eflujo, Deficiencias a) Reducción de flia. RND en porinas permeabilidad OmpF, OmpC Review: Hooper DC. EID 7: 337–41, 2001
1
Adquisición secuencial de resistencia a quinolonas Aislamiento sin mecanismos R quinolonas
-↓ conc. CIP Aislamiento con ↓↓sensibilidad -Tx NAL CIP y NALR
Frec. Frec. mutació mutación 10-6-10-8
Aislamiento CIPR y ↑↑NALR
Presión antibiótica
Frec. Frec. mutació mutación 10-6-10-8
CIM (µg/ml)
Concentración que previene la selección de mutantes (CPM) Mínima concentración de antibiótico requerida para prevenir el crecimiento de mutantes resistentes
Frec. Frec. mutació mutación 10-6-10-8
CIM (µg/ml)
CIM (µg/ml)
CIP
NAL
CIP
NAL
CIP
NAL
16
512
16
512
16
512
2
256
2
256
2
256
0,06
8
0,06
8
0,06
8
WT
2 mutaciones gyrA + 1 en par C + acumulación deficiente + etc.
2º mutación gyrA 1º mutación gyrA + 1° parC, o acumulación deficiente
1° mutación gyrA
CPM: ventana de selección de mutantes
CPM ~ CIMmutante Metodología: inóculo 1010 bacterias en agar MH con ≠ [ATB]; incubación 72-96 hs a 37ºC y recuento de sobrevivientes Marcusson LL, y col., J Antimicrob Chemother 55: 938–943, 2005
B.Mecanismos Plasmídicos (transferibles) de Resistencia Review: Rodríguez-Martínez JM, y col. a Quinolonas: PMQRs
Concentracion de droga
J Infect Chemother 17: 149-82, 2010
3. Protección de sitios blanco del ATB: proteína Qnr protege ADN girasa y Topo IV dificultando la unión con quinolonas. “Cinco” clases de genes, con varios alelos en cada clase1:
Ventana de seleccion de mutantes
CPM
QnrVC1, 4 qnrA1 – A7 64% id qnrB1 – B32 QnrC1 70% id qnrS1 – S4 67% id 60% id qnrC1 qnrVC12 QnrS1 QnrE4 qnrD1 qnrVC43
Tiempo post administración Zhao X and Drlica K. Clin Infec Dis 33(suppl 3): S147-S156, 2001
PMQRs ...
A. Nalidíxico
H2N H2N
Incremento
4 0,008 0,015 0,008 0,03 0.008
8 – 32 0,125 – 2 0,250 – 1 0,250 – 1 0,500 – 1 0,250 – 1
2 – 8x 16 – 256x 16 – 64x 32 – 125x 16 – 32x 32 – 125x
http://www.lahey.org/qnrStudies
Excepto NAL (8-32 vs 256) ~ 1º mutación QRDR 2 3 4
Fonseca y col., EID 14: 1129-31, 2008 Xia y col., AAC 54: 3471-4, 2010 Sun y col., 50th ICAAC (C1-1425) 2010
CH2OH O 2” HO
O CO HN
HO OH
2’
3’
NH2
H3C
N
F N HN
Robicsek A, y col. Nat Medicine 12: 83-8, 2006
Detectado en E. coli (clínicos y animales), E. cloacae y K. penumoniae, en Bélgica, Francia, Turquía (49th ICAAC, abstr. C2-707, SFO, USA 2009), Japón, China y Canadá1 Frecuentemente asociado a rmtB (metilasa ARNr 16S)
N O
CH3
Nuevo alelo, qepA2, dos mutaciones puntuales2
O F
COOH
N
N CH3
Norfloxacina
2 mutaciones puntuales: W102R, D179Y
H3C
N
O
HO
COOH
N
N CH3
NH2
AAC(6’)-Ib
O F
COOH
OH 6’
O 3
O
OH 4’
O
Levofloxacina
5. Eflujo específico para FQ, bomba de 1 componente familia MFS: QepA, sólo quinolonas muy hidrofílicas, como NOR, CIP y enrofloxacina (vet)
– qepA
+ qepA
Incremento
Norfloxacina Ciprofloxacina Enrofloxacina
0,016 0,004 0,008
0,250 0,063 0,250
16x 16x 32x
Gatifloxacina Levofloxacina Sparfloxacina
0,004 0,008 0,001
0,016 0,016 0,002
4x 2x 2x
A. Nalidíxico
1
1
1x
y col. ERAIT 6: 685–11, 2008
2 Cattoir
COOH N
HN
Ciprofloxacina
AAC(6’)1b-cr acetila “NH” de grupo piperazina de NOR, CIP: incremento en CIMes ~ 4x
> hidrofobicidad
Amikacina H
A. nalidíxico Ciprofloxacina Levofloxacina Gatifloxacina Moxifloxacina Sparfloxacina
+ qnr
64% id
QnrD1
PMQRs ...
4. Modificación enzimática del ATB: enzima AAC(6’)-1b, inactivante de aminoglicósidos, kanamicina, amikacina, tobramicina, acetilación de grupo “NH2”:
H
1
– qnr
QnrB1
47% id 60% id
CIM de E. coli (µg/ml)
CIM
HO
41% id
QnrA1
1 Martínez-Martínez
qnr yy ~~ qnr aac(6’)-Ib-cr aac(6’)-Ib-cr
V, y col., AAC 52: 3801–4, 2008
2
PMQRs...
Perfiles de resistencia: 115 aislam. clínicos
(Argentina 2005-2008)
con sensibilidad disminuida a quinolonas Diámetro del halo de inhibición (mm)
Mecanismo de resistencia
NAL
CIP
LEV
AKN
Ninguno (WT)
24 – 34
30 – 45
30 – 44
20 – 25
≤ 12
26 – 33
26 – 33
20 – 25
qnr
9 – 20
13 – 27
16 – 29
20 – 25
aac(6’)-Ib-cr
22 – 26
15 – 27
22 – 33
16 – 22
9 – 19
6 – 21
13 – 28
12 – 22
≥17 14 – 16 ≤13
≥17 15 – 16 ≤14
QRDR (1° gyrA)1
qnr + aac(6’)-Ib-cr 1
Los PMQRs están fuertemente asociados a otros mecanismos de resistencia: ß-lactamasas de espectro extendido (BLEEs) ß-lactamasas de tipo AmpC Resistencia a trimetoprima-sulfametoxazol Resistencia a aminoglicósidos Resistencia a carbapenemes Resistencia a cloranfenicol
Cavaco LM and Aarestrup FM, J Clin Microbiol 47: 2751 – 8, 2009
CLSI S I R
≥19 14 – 18 ≤13
≥21 16 – 20 ≤15
ARGENTINA, PMQRs
Epidemiology of PMQRs in Argentina: Differential Distribution in Enterobacteria P. Andres, A. Soler Bistué, C. Lucero, M. Tolmasky, A. Corso, A. Petroni 50th ICAAC (abstr. C2-1471), Boston, USA 2010
112 enterobacterias 33 htales. y clínicas privadas
Enero 2005 a Diciembre 2008 24% (27) E. coli
qnrB9 (Kpn, Córdoba 1988),
Jacoby GA y col. AACh 53: 1665-6, 2009
qnrS1
Andres P y col. Plasmid Mediated Quinolone Resistance Mechanisms in
Clinical Enterobacteria from Argentina: A View from the Microbilogical Practice 49th Intersci. Conf. Antimicrob. Agents Chemother. (abstr C2-716), San Francisco, USA 2009
Andres P y col., 50th ICAAC 2010 …
Distribución PMQRs
1. Global (n = 112):
34% Klebsiella
34% (38) qnr
31% 15/24 “cr” + wt 9/24 “cr” sóla
8%
4% (5) aac(6’)-Ib-cr
9% Enterobacter
100
19/19 qnrB10 5/5 qnrS1
80
42% aac(6’)-Ib-cr
40
aac(6’)-Ib-cr
71% (80/112) CIP ≥ 21mm, CLSIS 45% (36/80) con PMQRs
Disociación LEV-CIP: N 30 25 20
∆ ≤ 4 mm
∆ ≥ 5 mm
10
60
28/28 qnrB19 Ent Kle Eco Sal
2% aac(6’)-Ib-cr
SIN aac(6’)-Ib-cr CIP: 13 a 31 mm
CON aac(6’)-Ib-cr CIP: 6 a 26 mm
5 -4 -3 -2 -1 0
100
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14
∆halos LEV – CIP (mm) P ≤ 0,003
E = 99%
S = 96%
VPN = 99% VPP = 96%
40
20
aac(6’)-Ib-cr : en 14 centros, CABA y 5 provincias
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR: PCR y secuenciación de genes qnrA, -B, -C, -D, -S y aac(6’)-Ib-cr
80
60
qnrB10, 19, 1, 2 y S1: 21 centros, CABA y 9 provincias
8 Ecl, 2 Eae
8 S. marcescens 3 S. flexneri 1 M. morganii 2 P. mirabilis
15
2. Especies mayoritarias: Kle (38); Eco (27); Sal (23); Ent (10): ~ % PMQRs qnr
62/112 aislamientos
PMQRs en ARGENTINA: presencia de aac(6’)-Ib-cr
17% (19) qnr + aac(6’)-Ib-cr 61%
PMQRs: 55%
21% (23) Salmonella spp
35 Kpn, 3 Kox
CABA y 12 provincias
20
Ent Kle Eco Sal
3
QUINOLONAS Correlació Correlación entre el uso de Fluoroquinolonas y el aumento de la resistencia. Añ Años 19901990-2000 UCI, USA, N= 35.790
Marcelo Galas Servicio Antimicrobianos, Dto Bacteriología Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, Buenos Aires Neuhauser et al. JAMA, February 2003; 289:885-888
Salmonella spp.
CLSI (Ex NCCLS) 2003
DETECCION DE RESISTENCIA A CIPROFLOXACINA Puntos de corte según NCCLS
• Salmonella y Reducida Sensibilidad a
Fluorquinolonas
S
I
Método de dilución
< 1 μg/ml
2 μg/ml
> 4 μg/ml
R
Método de difusión
> 21 mm
16-20 mm
< 15 mm
Puntos de corte según Criterio Poblacional
Tabla 2A, Enterobacterias (M2 y M7)
S
R > 0,25μg/ml (ó 0,125 μg/ml??)
Método de dilución
Disco de Ac. Nalidí Nalidíxico < 13 mm: Sensibilidad disminuí disminuída a CIP
Salmonella spp.
Salmonella spp. Distribución de Halos para CIPRO
Distribución de Halos para NAL 200
160 R
I
S
n 150
140
n
I
S
120 100
100
80
50
40
60 20 0
0 6 7 8 9 10 1112 13 1415 16 1718 19 2021 22 2324 25 2627 28 2930 31 32
halos (mm)
19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46
NAL S
Halo (mm)
NAL R
4
Salmonella: Cipro vs Nal NAL
AM
Mutación gyrA
KPN Distribución de halos de CIP Red WHONET-Argentina. Año 2005 (N=1375)
% de Cepas
20
CIP NAL
15 10 5 0
CRO
CIP
6
Cepa salvaje
KPN Distrib de halos de CIP según sensibilidad a NAL Red WHONET-Argentina. Año 2005 (N=1375)
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
>35
Porcentajes de resistencia y sensibilidad disminuida a CIP en enterobacterias de Argentina Red WHONET añ año 2004 (n=3.520) 60%
20 % de Cepas
8
50%
15
40% 30%
10
20% 10%
5
0%
0
mmo (37) eco (2142)
6
8
10
12
14
16
18
NAL S
NAL R ó I + CIP S
20
22
NAL I
24
26
28
30
32
34
>35
NAL R
11 % de los aislamientos
Los PMQRs confieren bajos niveles de R..., A. FACTORES BACTERIANOS
relevancia clínica?
kox (62)
pmi (214)
pvu (33)
CIP S-NAL R
kpn (557)
CIP R-NAL R
eae (59)
ecl (195)
cfr (59)
sma (111)
TOTAL
NAL RR-CIP S = 55-8 % del total de las enterobacterias 1/3 de las que tienen R a NAL
ENTEROBACTERIAS
1. Genética: mayor ocurrencia Frecuencia evento conjugación ~10-5 vs 10-8 selección 1º mut. QRDR
2. Concentración que previene selección de mutantes (CPM): qnrA, aac(6’)-Ib-cr (3,2 µg/ml) vs wild-type (0,125 µg/ml)
E. coli WT E. coli qnrA1 E. coli aac(6’)-Ib-cr
Concentración sérica
100 veces > frecuencia selección mutantes QRDR CPM Kpn clínicas: 4-128 µg/ml Rodríguez-Martínez JM, y col., AAC 51: 2236-9, 2007
25 x Robicsek A, y col., Lancet Infect Dis 6: 629-40, 2006
Resistencia a fluoroquinolonas
5
Distribución de halo de inhibición de CIP en enterobacterias NALS o NALR (N = 3520, año 2004)
PMQRs y relevancia clínica
4. Corea 1998-2006 (Htal. de Univ. Nacional de Seúl): aislamientos (HC) consecutivos de Kpn, Eco, Enterobacter spp. Kim HB y col., AACh 53: 639-45, 2009 Correlación Emergencia de PMQRs vs Resistencia a CIP
Los PMQRs favorecerían emergencia de mutaciones QRDR que
S
confieren altos niveles resistencia a FQ % aislamientos con mutaciones QRDR (gyrA, parC)
I R
NALnoS CIPS
1999 – 2001 (n=
35
753)
30
Cambios R a NAL y CIP en Salmonella sp.-1999-2001 vs 2009 (n=1272)
25 20 15 10 5
Ácido nalidíxico
0 8
11
14
17
20
23
1998-1999
2000-2001
2005-2006
Prob.
46 0
58 27
50 50
P = 0,012
NO producen PMQR Producen PMQR
RELACIÓN ENTRE AUC0-24hs / CIM Y LA CURVA CLÍNICA Y MICROBIOLOGICA DE 64 PACIENTES CON INFECCIONES GRAVES, TRATADOS CON CIPRO I.V. (Antimicrob Agents Chemother. 1993; 37: 1073-1081) 100
Porcentaje de pacientes curados
16
7
22
Clinico
80
Microbiológico
Ciprofloxacina 26
1era mutación en gyrA
29
32
35
2009 (n=519
35
60 9
)
30
10
40
25 20
20
15 10 5
0 0-62.5
Ácido
0 8
11
14
17
20
23
62.5-125
26
29
32
125-250
250-500
>500
AUC/MIC a 24 hs.
Ciproflox 35
Probable PMQRs (mecanismos plasmídicos de resistencia a FQ
1) DETERMINAR PUNTOS DE CORTE
UTILIDAD DE LOS PUNTOS DE CORTE ACTUALES PARA LAS QUINOLONAS FLUORADAS
DOSIFICACION DE LEV CONOCIDA (500 mg/24h) QF
AUC CONOCIDA (65 mg.h/l)
+ PARAMETRO INDICADOR DE ÉXITO = AUC/CIM > 125
Para éxito: AUC/CIM=125
CC AT B
Si AUC=65 CIM= AUC/125= 65/125= 0,52 µg/ml CIM Para CIMs >0,5 ➟ AUC/CIM
